Emner Overdækket
Baggrund
Lysspredning som en karakterisering Tool
Termisk Denaturering
De kvartære struktur af proteiner
Aggregation
Størrelsesfordelingen som en funktion af ionstyrken
MW og Virial Koefficient
Form Skøn
HPPS
Tekniske specifikationer
Baggrund
Stabiliteten af et protein formulering til en række af opløsningen forstyrrelser er afgørende for dets succes som et lægemiddel. På grund af følsomheden af protein til løsning ændringer, kan invasive teknikker til karakterisering være problematisk. Lysspredning er en non-invasiv teknik, der har fået bred accept i det område af protein og formulering karakterisering.
Lysspredning som en karakterisering Tool
Spredningen intensiteten af et lille molekyle er proportional med kvadratet på molekylvægt. Som sådan, dynamisk og statisk lysspredning teknikker er meget følsomme over for udbrud af protein aggregering følge af subtile ændringer i løsningen betingelser. Nutidens generation af lysspredning instrumentering omfatter meget stabile lasere, fiberoptik, høj hastighed correlators, og en enkelt foton tælle detektorer at lette målingen af protein prøver på tværs af en vifte af størrelse og koncentration, der har aldrig før været opnåelige.
Termisk Denaturering
Strukturen af et protein er stabiliseret af et stort antal af hydrogenbindinger, hydrofobe interaktioner, og Van der Waal kræfter, som hver især bidrager med en lille grad af stabilitet til den overordnede struktur. Da energi er tilføjet til systemet via en stigning i temperaturen, kan den stabiliserende kræfter blive forstyrret, så protein til at udfolde sig eller denaturere. Den temperatur, hvorved dette denaturering sker, er defineret som det protein smeltepunktet.
Når et protein denaturerer, er de hydrofobe rester begravet i det indre af den foldede struktur udsat for opløsningsmidler. Denne entropically ugunstige tilstand er hurtigt erstattet dog med den ene hvori de hydrofobe rester på den ene protein kæde forbinder med dem på et andet protein kæde. På grund af den molekylære vægt afhængighed af spredt intensitet, er denne ikke-specifikke aggregering af denaturerede proteiner nemt overvåges med lysspredning instrumentering. Figur 1 viser en temperatur scanning for kvæg hæmoglobin, og tydeligt viser en kraftig stigning i både størrelse og spredning intensitet ved smeltepunkt på 45,5 ° C.
Figur 1. Termisk scanne for kvæg hæmoglobin i 0,13 M fosfat-buffer saltvand, hvilket indikerer et smeltepunkt på 45,5 C.
De kvartære struktur af proteiner
Den kvaternære struktur eller bestilles selvstændig forening tilstand af et protein kan være påvirket af løsningen egenskaber såsom pH og ionstyrke. Præcisionen af dynamisk lysspredning målinger er tilstrækkelig til at adskille ændringer i protein-kvaternære struktur. For eksempel Figur 2 viser den målte størrelse distributioner for mennesker og kvæg insulin ved pH 2 og pH 7. Ved pH 2, er de målte diametre for både proteiner (se tabel 1) i overensstemmelse med dimerisk kvaternære strukturer, hvor den molekylære vægt er estimeret ud fra empirisk bestemt størrelse vs masse relationer. Ved pH 7, er de målte diametre overensstemmelse med den kendte hexameric former af proteiner ved fysiologisk pH.
Figur 2. Størrelse distributioner for mennesker og kvæg insulin ved pH 7 og pH 2, hvilket tyder på en pH-afhængig ændring i kvaternære struktur.
Tabel 1. Sammenligning af pH-afhængig beregnede og kendt molekylvægt værdier for mennesker og kvæg insulin.