Protein Kennzeichnung Unter Verwendung der Dynamischen u. Statischen Lichtstreuungs-Techniken Von Malvern-Instrumenten

Themen Umfaßt

Hintergrund
Lichtstreuung als Kennzeichnungs-Hilfsmittel
Thermische Denaturierung
Die Quaternäre Zelle von Proteinen
Anhäufung
Korngrößenverteilung als Funktion der IonenStärke
MW und Virial-Koeffizient
Form Schätzungen
HPPS
Technische Bedingungen

Hintergrund

Die Stabilität einer Proteinformulierung zu einer Vielzahl von Lösungsstörungen ist zu seinem Erfolg als Arzneimittel kritisch. Wegen der Empfindlichkeit des Proteins zu den Lösungsänderungen, können invasive Kennzeichnungstechniken problematisch sein. Die Lichtstreuung ist eine nichtinvasive Technik, die breite Abnahme im Bereich des Proteins und der Formulierungskennzeichnung empfangen hat.

Lichtstreuung als Kennzeichnungs-Hilfsmittel

Die Zerstreuenintensität eines kleinen Moleküls ist zum Quadrat des Molekulargewichtes proportional. Als solches sind dynamische und statische Lichtstreuungstechniken für den Anfang der Proteinaggregation ergebend aus subtilen Änderungen in Lösungszuständen sehr empfindlich. Heutige Generation der Lichtstreuungsinstrumentierung umfaßt in hohem Grade stabile Laser, Faseroptik, Hochgeschwindigkeitskorrelatoren und das einzelne Photon, das Detektoren zählt, die das Maß von Proteinproben über einer Reichweite der Größe und der Konzentration ermöglichen, die nie vorher erreichbar gewesen ist.

Thermische Denaturierung

Die Zelle eines Proteins wird durch viele Wasserstoffanleihen, hydrophoben Interaktionen und Kräfte Vans Der Waal stabilisiert, von denen jede einen kleinen Grad an Stabilität zur Gesamtzelle beiträgt. Während Energie der Anlage über einen Temperaturanstieg hinzugefügt wird, können die stabilisierenden Kräfte gestört werden und das Protein aufklappen oder denaturieren lassen. Die Temperatur, bei der diese Denaturierung auftritt, wird als der Proteinschmelzpunkt definiert.

Wenn ein Protein denaturiert, werden die hydrophoben Rückstände, die innerhalb des Innenraums der gefalteten Zelle begraben werden, dem Lösungsmittel ausgesetzt. Dieser entropically ungünstige Zustand wird bald jedoch, durch einen worin die hydrophoben Rückstände auf einem Proteinkettenmitarbeiter mit denen auf einer anderen Proteinkette ersetzt. Wegen der Molekulargewichtabhängigkeit der Zerstreuenintensität, wird diese unspezifische Anhäufung von denaturierten Proteinen leicht mit Lichtstreuungsinstrumentierung geüberwacht. Abbildung 1 zeigt einen Temperaturscan für Rinderhämoglobin, und zeigt offenbar eine steile Zunahme der Größe und Zerstreuenintensität am Schmelzpunkt von 45.5°C. an.

Abbildung 1. Thermischer Scan für Rinderhämoglobin in 0,13-M-phosphatgepuffertem salzigem, einen Schmelzpunkt von 45,5 C. anzeigend.

Die Quaternäre Zelle von Proteinen

Die quaternäre Zelle oder bestellte der Selbstassoziationszustand eines Proteins können durch Lösungseigenschaften wie den pH und die Ionenstärke beeinflußt werden. Die Präzision von dynamischen Lichtstreuungsmaßen ist genügend, Änderungen in der quaternären Zelle des Proteins zu unterscheiden. Zum Beispiel Abbildung 2 zeigt die gemessenen Korngrößenverteilungen für menschliches und Rinderinsulin bei pH 2 und pH 7. Bei pH 2, die gemessenen Durchmesser für beide Proteine (sehen Sie, dass Tabelle 1) mit zweiteiligen quaternären Zellen in Einklang sind, in denen das Molekulargewicht von empirisch entschlossener Größe gegen Massen-Verhältnisse geschätzt wird. Bei pH 7, sind die gemessenen Durchmesser mit den bekannten hexameric Formularen der Proteine an physiologischer Ph. in Einklang.

Abbildung 2. Korngrößenverteilungen für menschliches und Rinderinsulin bei pH 7 und pH 2, eine pH-abhängige Änderung in der quaternären Zelle anzeigend.

Tabelle 1. Vergleich der pH-abhängigen berechneten und bekannten Molekulargewichtwerte für menschliches und Rinderinsulin.

pH

Durchmesser (nm)

Mext (kDa)

Mknown (kDa)

Formular

Menschlich

2

3,30

10,9

11,4

Dimer

7

5,37

33,9

34,2

Hexamer

Rinder

2

3,47

12,2

-

Dimer

7

5,33

33,4

-

Hexamer

Anhäufung

Formulierungszusätze, wie Seifen und Salze, können einen ausgeprägten Einfluss auf die Oberflächenladungsdichte des Proteins und der Lösungsionenstärke haben. Subtile Schwankungen des irgendeines dieser Parameter können den Unterschied zwischen einer stabilen Formulierung und einer Beispielanhäufung bedeuten. Wegen seiner Empfindlichkeit zu den Partikeln des hohen Molekulargewichts, ist die dynamische Lichtstreuung ein nützliches Hilfsmittel für das Überwachen der Effekte der Formulierungszusätze auf Proteinaggregation.

Korngrößenverteilung als Funktion der IonenStärke

Abbildung 3 zeigt eine Überlagerung der Korngrößenverteilung für Rinderserumalbumin als Funktion der Ionenstärke am isoionischen Punkt von pH 4,8. Für NaCl-Konzentrationen <0.5 M, ist die Korngrößenverteilung, mit einem hydrodynamischen Durchmesser von ungefähr 8,5 nm monomodal. Für NaCl-Konzentrationen <0.5M, ist die Korngrößenverteilung multimodal und zeigt das Vorhandensein der Proteinaggregation an.

Abbildung 3. Korngrößenverteilungen für menschliches und Rinderinsulin bei pH 7 und pH 2, eine pH-abhängige Änderung in der quaternären Zelle anzeigend.

MW und Virial-Koeffizient

Für kleine Moleküle wie Proteine, kann die Probe, die Intensität zerstreut, unter Verwendung des Rayleigh-Ausdrucks beschrieben werden, der in Gleichung 1 gezeigt wird, wo K eine optische Konstante ist, C ist die Proteinkonzentration, ist R das Rayleigh-Verhältnis der Parameterintensität zur Vorfallintensität, ist M das durchschnittliche Molekulargewicht des Parameters des Gewichts, und A ist der 2. virial Koeffizient.

                        (1)

Wie in Gleichung 1 vorgeschlagen, sollte ein Plan von KC/R gegen C, mit einem Abfangen linear sein, das mit 1/M und Steigung, die, gleichwertig ist zum virial Koeffizienten 2 proportional ist. Dieses Baumuster der einzelnen Molekulargewichtanalyse des Winkels bekannt als Debye-Plan. Ein Beispiel wird in Abbildung 4 genannt, die die Debye-Pläne für Lysozym im 0,1-M-Essigsäurebuffer und in 0,13-M-phosphatgepuffertem salzigem zeigt. Das Abfangen in beiden Plänen ist mit dem bekannten Molekulargewicht von kDa 14,7 in Einklang. Wie in Abbildung 4 jedoch gesehen, sind die 2 virial Koeffizienten nach dem Baumuster des Buffers verwendet stark abhängig.

Abbildung 4. Debye-Pläne für Lysozym im 0,10-M-Essigsäurebuffer und in 0,13-M-phosphatgepuffertem salzigem.

Form Schätzungen

In den dynamischen Lichtstreuungsmaßen wird die hydrodynamische Größe vom gemessenen Diffusionskoeffizienten über Schürt Einstein-Gleichung berechnet, in der ein Baumuster der harten Kugel angenommen wird. Abweichungen in der Kugelgestalt werden in einer Zunahme der hydrodynamischen Größe reflektiert, die mit der Größe verglichen wird, die für eine harte Kugel des bekannten Molekulargewichtes berechnet wird. Von Perrin-Theorie kann der Unterschied bezüglich dieser zwei Werte, d.h. hydrodynamische Größe und die Größe der harten Kugel, verwendet werden, um das Achsenverhältnis für ein Ellipsoid mit den gleichen diffusen Eigenschaften zu schätzen.

Abbildung 5 zeigt eine Darstellung der Kristallstruktur für Lysozym und umfaßt die geometrischen axialen Abmessungen. Der rote Kreis ist Vertreter der Größe einer hypothetischen harten Kugel für das kDa Protein 14,7 (spezifisches Volumen = 0,73 mL/g). Der grüne Kreis ist der Vertreter der hydrodynamischen Größe, berechnet vom gemessenen Diffusionskoeffizienten. Der Unterschied bezüglich gemessen und der Sollwerte ist mit einer Ellipsoidpartikelform mit einem Achsenverhältnis 1,73 in Einklang, identisch zum Achsenverhältnis, das geometrisch bestimmt wird.

Abbildung 5. Darstellung des Lysozyms, die geometrischen axialen Abmessungen, den Durchmesser der harten Kugel (rot), hydrodynamischen Durchmesser (Grün) und ein Ellipsoid mit den gleichen diffusen Eigenschaften wie das Protein (Schwarzes) zeigend.

HPPS

Der Hochleistungs-Partikel Sizer (HPPS) von Malvern-Instrumenten wurde speziell konstruiert, um die niedrigen Konzentrationsbedingungen zu erfüllen, die gewöhnlich mit Proteinanwendungen, zusammen mit den Anforderungen der hohen Konzentration für kolloidale Anwendungen verbunden sind. Diese eindeutige Mischung von Anforderungen Zufriedenzustellen war über die Integration einer optischen Rückstreuauslegung erreicht, und als Folge dieser Auslegung, überschreiten die Bedingungen weit die für jedes andere dynamische Lichtstreuungsinstrument. Die HPPS-Kleinteile sind das optimierende Selbst, und die Software umfaßt eine eindeutige Maßnahme „mit einen Klicks“, analysiert und berichtet über das Merkmal, das konstruiert wird, um die Lernkurve herabzusetzen.

Technische Bedingungen

Parameter

Bedingungen

Größenreichweite (Durchmesser)

0.6nm bis 6µm

Konzentrationsbereich

0,1 mg/ml Lysozym zu 20% W/V

Probenmenge

12µL zu 2mL

Laser

Er-Ne, 3.0mW 633nm

Detektor

Lawinenphotodiode

Temperaturregler

10°C zu 55°C (am umgebenden Temp 20°C)

Erweitertes Tempgerät

10°C zu 90°C (am umgebenden Temp 20°C)

Quelle: „Protein-Kennzeichnung Unter Verwendung der Dynamischen u. Statischen Hellen Streuung“, Anwendungs-Anmerkung durch Malvern-Instrumente.

Zu mehr Information über diese Quelle besuchen Sie bitte Malvern Instruments Ltd (GROSSBRITANNIEN) oder Malvern-Instrumente (USA).

Date Added: Apr 20, 2005 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 01:25

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