Protein Charakterisierung mittels Dynamic & Static Light Scattering Techniken aus Malvern Instruments

Behandelte Themen

Hintergrund
Light Scattering als Charakterisierung Werkzeug
Thermischen Denaturierung
Die Quartärstruktur der Proteine
Aggregation
Size Distribution als Funktion der Ionenstärke
MW und Virialkoeffizient
Shape-Schätzungen
HPPS
Technische Daten

Hintergrund

Die Stabilität eines Proteins Formulierung einer Vielzahl von Störungen Lösung ist entscheidend für seinen Erfolg als ein pharmazeutisches Produkt. Wegen der Empfindlichkeit des Proteins in Lösung ändert, können invasive Charakterisierung Techniken problematisch sein. Die Lichtstreuung ist eine non-invasive Technik, die eine breite Akzeptanz erhalten hat, auf dem Gebiet der Protein-und Formulierung Charakterisierung.

Light Scattering als Charakterisierung Werkzeug

Die Streuintensität eines kleinen Moleküls ist proportional zum Quadrat des Molekulargewichts. Als solche dynamische und statische Lichtstreuung Techniken sind sehr empfindlich auf das Auftreten von Protein-Aggregation, die sich aus subtilen Veränderungen in der Lösung Bedingungen. Die heutige Generation der Lichtstreuung Instrumentierung beinhaltet hochstabile Laser, Faseroptik, High-Speed-Korrelatoren und Single Photon Counting-Detektoren, die die Messung von Protein-Proben zu erleichtern einer ganzen Reihe von Größe und Konzentration, die noch nie zuvor erreichbar.

Thermischen Denaturierung

Die Struktur eines Proteins wird durch eine große Zahl von Wasserstoffbrücken, hydrophobe Wechselwirkungen und Van-der-Waals Kräfte, von denen jeder ein kleines Maß an Stabilität trägt zur allgemeinen Struktur stabilisiert. Als Energie wird dem System über eine Erhöhung der Temperatur hinzugefügt haben, können die stabilisierenden Kräfte gestört werden, so dass das Protein zu entfalten oder zu denaturieren. Die Temperatur, bei der diese Denaturierung auftritt, wird als das Protein Schmelzpunkt definiert.

Wenn ein Protein denaturiert, sind die hydrophoben Reste im Inneren des gefalteten Struktur begraben, um das Lösungsmittel ausgesetzt. Diese entropisch ungünstigen Zustand ist bald jedoch mit einem, wobei die hydrophoben Reste auf einer Proteinkette assoziieren mit denen auf ein anderes Protein-Kette ersetzt. Da das Molekulargewicht Abhängigkeit der Streuintensität, ist diese unspezifische Aggregation von denaturierten Proteinen leicht mit Lichtstreuung Instrumentierung überwacht. Abbildung 1 zeigt eine Temperatur-Scan für Rinderhämoglobin und zeigt deutlich einen starken Anstieg sowohl der Größe und der Streuintensität am Schmelzpunkt von 45,5 ° C.

Abbildung 1. Thermal Scan für Rinderhämoglobin in 0,13 M Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, was auf einen Schmelzpunkt von 45,5 C.

Die Quartärstruktur der Proteine

Die Quartärstruktur oder bestellt Selbstassoziation Zustand eines Proteins durch Lösung Eigenschaften wie pH-Wert und der Ionenstärke beeinflusst werden kann. Die Genauigkeit der dynamischen Lichtstreuung ist ausreichend, um Änderungen im Protein Quartärstruktur unterscheiden. Zum Beispiel Abbildung 2 zeigt die gemessenen Größenverteilungen für Human-und Rinder-Insulin bei pH 2 und pH 7. Bei pH 2 sind die gemessenen Durchmesser für beide Proteine ​​(siehe Tabelle 1) im Einklang mit dimere Quartärstruktur, wo das Molekulargewicht von empirisch ermittelten Größe vs Masse Beziehungen geschätzt wird. Bei pH 7 sind die gemessenen Durchmesser stimmen mit den bekannten hexameren Formen der Proteine ​​bei physiologischen pH-Wert.

Abbildung 2. Größenverteilungen für Human-und Rinder-Insulin bei pH 7 und pH 2, was auf eine pH-abhängige Veränderung der Quartärstruktur.

Tabelle 1. Vergleich der pH-abhängig berechnet und bekannt Molekulargewicht Werte für Mensch und Rind Insulin.

Aggregation

Formulierung Additive, wie Seifen und Salze, kann einen ausgeprägten Einfluss auf die Oberflächen-Ladungsdichte des Proteins und der Ionenstärke der Lösung. Subtilen Variationen in einer dieser Parameter kann den Unterschied zwischen einer stabilen Formulierung und Probe-Aggregation. Wegen seiner Empfindlichkeit gegenüber hochmolekularen Teilchen, ist die dynamische Lichtstreuung ein nützliches Werkzeug für die Überwachung der Auswirkungen der Formulierung Additive auf die Protein-Aggregation.

Size Distribution als Funktion der Ionenstärke

Abbildung 3 zeigt eine Überlagerung der Größenverteilung für Rinderserumalbumin als Funktion der Ionenstärke bei den isoionischen Punkt von pH 4,8. Für NaCl-Konzentrationen <0,5 M, ist die Größenverteilung monomodalen, mit einem hydrodynamischen Durchmesser von ca. 8,5 nm. Für NaCl-Konzentrationen <0,5 M wird die Größenverteilung multi-modal, was die Anwesenheit von Protein-Aggregation.

Abbildung 3. Größenverteilungen für Human-und Rinder-Insulin bei pH 7 und pH 2, was auf eine pH-abhängige Veränderung der Quartärstruktur.

MW und Virialkoeffizient

Für kleine Moleküle wie Proteine, die Probe Streuintensität beschrieben werden kann mit dem Rayleigh Ausdruck in Gleichung 1, wobei K eine optische Konstante gezeigt werden, C die Protein-Konzentration ist, ist R der Rayleigh-Verhältnis des Analyten Intensität der einfallenden Intensität, M ist das Gewichtsmittel Analyten Molekulargewicht und A ist der 2. Virialkoeffizienten.

(1)

Wie in Gleichung 1 vorgeschlagen, sollte ein Grundstück von KC / R vs C linear sein, mit einem Intercept-äquivalent zu 1 / M und die Steigung, die proportional zu den 2 Virialkoeffizienten ist. Diese Art der einzelnen Winkel Molekulargewicht Analyse ist als Debye Plot bekannt. Ein Beispiel ist in Abbildung 4, die die Debye-Plots für Lysozym in 0,1 M Essigsäure-Puffer und 0,13 M Phosphat gegeben Kochsalzlösung. Das fängt in beiden Grundstücke sind konsistent mit den bekannten Molekulargewicht von 14,7 kDa. Wie in Abbildung 4 zu sehen sind jedoch die 2 Virialkoeffizienten stark abhängig von der Art des verwendeten Puffers.

Abbildung 4. Debye Plots für Lysozym in 0,10 M Essigsäure-Puffer und 0,13 M Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung.

Shape-Schätzungen

In dynamischen Lichtstreuung wird die hydrodynamische Größe aus der gemessenen Diffusionskoeffizienten über die Stokes-Einstein-Gleichung, wo eine harte Kugel-Modell wird angenommen, berechnet. Abweichungen in Kugelform sind in einer Erhöhung der hydrodynamischen Größe im Vergleich zur Größe für eine harte Kugel mit bekanntem Molekulargewicht berechnet wird. Von Perrin Theoretisch kann der Unterschied zwischen diesen beiden Werten, dh hydrodynamischen Größe und die harte Kugel Größe verwendet werden, um die axiale Verhältnis für ein Ellipsoid mit den gleichen Diffusions-Eigenschaften zu schätzen.

Abbildung 5 zeigt eine Darstellung der Kristallstruktur für Lysozym und beinhaltet die geometrische axialen Abmessungen. Der rote Kreis steht stellvertretend für die Größe eines hypothetischen harte Kugel für den 14,7-kDa-Protein (spezifische Volumen = 0,73 ml / g). Der grüne Kreis steht stellvertretend für die hydrodynamische Größe, aus den gemessenen Diffusionskoeffizienten berechnet. Der Unterschied in der gemessenen und theoretischen Werten steht im Einklang mit einem Ellipsoid Partikelform mit einem Achsenverhältnis von 1,73, identisch mit dem Achsenverhältnis bestimmt geometrisch.

Abbildung 5. Vertretung von Lysozym, zeigt die geometrischen axialen Abmessungen, die harte Kugel Durchmesser (rot), hydrodynamischen Durchmesser (grün) und ein Ellipsoid mit den gleichen Diffusions-Eigenschaften wie das Protein (schwarz).

HPPS

Die High Performance Particle Sizer (HPPS) von Malvern Instruments wurde speziell entwickelt, um die geringe Konzentration Anforderungen in der Regel mit Protein-Anwendungen verbunden gerecht zu werden, zusammen mit der hohen Konzentration für kolloidale Anwendungen. Die Erfüllung dieses einzigartigen Mix von Anforderungen wurde durch die Integration eines Backscatter-Optik-Design erreicht, und als Folge dieser Konstruktion, die Spezifikationen wesentlich höher als bei anderen dynamischen Lichtstreuung Instrument. Die HPPS Hardware ist selbstoptimierend und die Software enthält eine einzigartige "one click" zu messen, zu analysieren und Report-Funktion entwickelt, um die Lernkurve zu minimieren.

Technische Daten

Quelle: "Protein Charakterisierung mittels Dynamic & Static Light Scatter", Application Note von Malvern Instruments.

Für weitere Informationen über diese Quelle besuchen Sie bitte Malvern Instruments Ltd (UK) oder Malvern Instruments (USA) .