Caracterización de la Proteína Usando Técnicas Dinámicas y Estáticas de la Dispersión Luminosa de los Instrumentos de Malvern

Temas Revestidos

Antecedentes
Dispersión Luminosa como Herramienta de la Caracterización
Desnaturalización Térmica
La Estructura de Cuaternario de Proteínas
Agregación
Distribución Dimensional en función de la Fuerza Iónica
MW y Coeficiente de Virial
Presupuestos de la Dimensión De Una Variable
HPPS
Pliegos De Condiciones Técnicos

Antecedentes

La estabilidad de una formulación de la proteína a una variedad de perturbaciones de la solución es crítica a su éxito como producto farmacéutico. Debido a la sensibilidad de la proteína a los cambios de la solución, las técnicas invasores de la caracterización pueden ser problemáticas. La dispersión Luminosa es una técnica no invasor que ha recibido la aceptación amplia en el área de la proteína y de la caracterización de la formulación.

Dispersión Luminosa como Herramienta de la Caracterización

La intensidad el dispersar de una pequeña molécula es proporcional al cuadrado del peso molecular. Como tal, las técnicas dinámicas y estáticas de la dispersión luminosa son muy sensibles al inicio de la agregación de la proteína que se presenta de cambios sutiles en las condiciones de la solución. La generación De Hoy de instrumentación de la dispersión luminosa incluye los laseres altamente estables, las fibras ópticas, los correladores de alta velocidad, y el único fotón que cuenta los detectores que facilitan la medición de las muestras de la proteína a través de un rango de la talla y de la concentración que ha sido nunca antes realizable.

Desnaturalización Térmica

La estructura de una proteína es estabilizada por un gran número de bonos de hidrógeno, de acciones recíprocas hidrofóbicas, y de fuerzas de Van der Waal, que contribuye un pequeño grado de estabilidad a la estructura total. Mientras Que la energía se agrega al sistema vía un aumento en temperatura, las fuerzas que se estabilizan se pueden romper, permitiendo que la proteína revele o desnaturalice. La temperatura en la cual esta desnaturalización ocurre se define como el punto de fusión de la proteína.

Cuando una proteína desnaturaliza, los residuos hidrofóbicos soterrados dentro del interior de la estructura plegable se exponen al disolvente. Este estado entropically desfavorable pronto se reemplaza sin embargo, por uno en donde los residuos hidrofóbicos en un socio de cadena de la proteína con ésos en otro encadenamiento de la proteína. Debido a la dependencia del peso molecular de la intensidad el dispersar, esta agregación no específica de proteínas desnaturalizadas se vigila fácilmente con la instrumentación de la dispersión luminosa. El Cuadro 1 muestra una exploración de la temperatura para la hemoglobina bovina, e indica sin obstrucción un claro aumento en la talla e intensidad el dispersar en el punto de fusión de 45.5°C.

El Cuadro 1. exploración Térmica para la hemoglobina bovina en fosfato de 0,13 M protegió salino, indicando un punto de fusión de 45,5 C.

La Estructura de Cuaternario de Proteínas

La estructura de cuaternario o el estado pedido de la autoasociación de una proteína se puede influenciar por las propiedades de la solución tales como el pH y la fuerza iónica. La precisión de las mediciones dinámicas de la dispersión luminosa es suficiente distinguir cambios en estructura de cuaternario de la proteína. Por ejemplo el Cuadro 2 muestra las distribuciones dimensionales medidas para la insulina humana y bovina en pH 2 y pH 7. En pH 2, los diámetros medidos para ambas proteínas (véase que el Cuadro 1) es constante con las estructuras de cuaternario diméricas, donde el peso molecular se estima de talla empírico resuelta comparado con lazos en masa. En pH 7, los diámetros medidos son constantes con los formularios hexameric sabidos de las proteínas en el pH fisiológico.

Cuadro 2. distribuciones Dimensionales para la insulina humana y bovina en pH 7 y pH 2, indicando un cambio relacionado del pH en estructura de cuaternario.

Comparación del Cuadro 1. de los valores calculados y sabidos del dependiente del pH del peso molecular para la insulina humana y bovina.

pH

Diámetro (nanómetro)

Mext (kDa)

Mknown (kDa)

Formulario

Humano

2

3,30

10,9

11,4

Dimero

7

5,37

33,9

34,2

Hexamer

Bovino

2

3,47

12,2

-

Dimero

7

5,33

33,4

-

Hexamer

Agregación

Los añadidos de la Formulación, tales como jabones y sales, pueden tener una influencia pronunciada en la densidad de carga superficial de la proteína y de la fuerza iónica de la solución. Las variaciones Sutiles en cualquiera de estos parámetros pueden significar la diferencia entre una formulación y una agregación estables de la muestra. Debido a su sensibilidad a las partículas de molecularidad elevada del peso, la dispersión luminosa dinámica es una herramienta útil para vigilar los efectos de los añadidos de la formulación sobre la agregación de la proteína.

Distribución Dimensional en función de la Fuerza Iónica

El Cuadro 3 muestra un papel de la distribución dimensional para la albúmina del suero vacuno en función de fuerza iónica en la punta isoiónica de pH 4,8. Para las concentraciones <0.5 M del NaCl, la distribución dimensional es monomodal, con un diámetro hidrodinámico de cerca de 8,5 nanómetro. Para las concentraciones <0.5M del NaCl, la distribución dimensional es multimodal, indicando la presencia de agregación de la proteína.

Cuadro 3. distribuciones Dimensionales para la insulina humana y bovina en pH 7 y pH 2, indicando un cambio relacionado del pH en estructura de cuaternario.

MW y Coeficiente de Virial

Para las pequeñas moléculas tales como proteínas, la muestra que dispersa intensidad se puede describir usando la expresión de Rayleigh mostrada en la Ecuación 1, donde está un constante K óptico, C es la concentración de la proteína, R es la relación de transformación de Rayleigh de la intensidad del analito a la intensidad del incidente, M es el peso molecular medio del analito de peso, y A es el 2do coeficiente virial.

                        (1)

Como se sugiere en la Ecuación 1, un gráfico de KC/R comparado con C debe ser lineal, con una interceptación equivalente hasta el 1/M y el declive que es proporcional al coeficiente virial 2. Este tipo de único análisis del peso molecular del ángulo se conoce como gráfico de Debye. Un ejemplo se da en el Cuadro 4, que muestra los gráficos de Debye para la lisozima en almacenador intermediaro del ácido acético de 0,1 M y salino protegida fosfato de 0,13 M. Las interceptaciones en ambos gráficos son constantes con el peso molecular sabido del kDa 14,7. Como se ve en el Cuadro 4 sin embargo, los 2 coeficientes virial son fuertemente relacionados sobre el tipo de almacenador intermediaro usado.

Cuadro 4. gráficos de Debye para la lisozima en almacenador intermediaro del ácido acético de 0,10 M y salino protegida fosfato de 0,13 M.

Presupuestos de la Dimensión De Una Variable

En mediciones dinámicas de la dispersión luminosa, la talla hidrodinámica se calcula del coeficiente de difusión medido vía Alimenta la ecuación de Einstein, donde se asume un modelo de la esfera dura. Las Desviaciones en esfericidad se reflejan en un aumento en la talla hidrodinámica comparada a la talla calculada para una esfera dura del peso molecular sabido. De la teoría de Perrin, la diferencia en estos dos valores, es decir talla hidrodinámica y la talla de la esfera dura, se puede utilizar para estimar la relación de transformación axil para un elipsoide con las mismas propiedades difusionales.

El Cuadro 5 muestra una representación de la estructura cristalina para la lisozima, e incluye las dimensiones axiles geométricas. El círculo rojo es representante de la talla de una esfera dura hipotética para la proteína 14,7 del kDa (volumen específico = 0,73 mL/g). El círculo verde es representante de la talla hidrodinámica, calculado del coeficiente de difusión medido. La diferencia en los valores medidos y teóricos es constante con una dimensión de una variable de la partícula del elipsoide con una relación de transformación axil de 1,73, idéntica a la relación de transformación axil determinada geométrico.

Cuadro 5. Representación de la lisozima, mostrando las dimensiones axiles geométricas, el diámetro de la esfera dura (rojo), el diámetro hidrodinámico (verde), y un elipsoide con las mismas propiedades difusionales que la proteína (negro).

HPPS

La Partícula Sizer del Alto Rendimiento (HPPS) de los Instrumentos de Malvern fue diseñada específicamente para cumplir los requisitos inferiores de la concentración asociados típicamente a aplicaciones de la proteína, junto con los requisitos de la alta concentración para las aplicaciones coloidales. La Satisfacción de esta mezcla única de requisitos era realizada vía la integración de un diseño óptico del retrodifusor, y como consecuencia de este diseño, los pliegos de condiciones exceden lejos ésos para cualquier otro instrumento dinámico de la dispersión luminosa. La dotación física del HPPS es uno mismo que optimiza, y el software incluye una dimensión única de “un tecleo”, analiza, y señala la característica diseñada para disminuir la curva de aprendizaje.

Pliegos De Condiciones Técnicos

Parámetro

Pliegos De Condiciones

Gama de tallas (diámetro)

0.6nm hasta los 6µm

Rango de Concentración

0,1 mg/ml Lisozima hasta el peso/volumen del 20%

Volumen de Muestra

12µL a 2mL

Laser

Él-Ne, 3.0mW 633nm

Detector

Fotodiodo del Alud

Control de la Temperatura

10°C a 55°C (en los temporeros ambiente 20°C)

Unidad Extendida de los temporeros

10°C a 90°C (en los temporeros ambiente 20°C)

Fuente: “Caracterización de la Proteína Usando la Dispersión Pálida Dinámica y Estática”, Nota de Aplicación por los Instrumentos de Malvern.

Para más información sobre esta fuente visite por favor Malvern Instruments Ltd (REINO UNIDO) o los Instrumentos de Malvern (los E.E.U.U.).

Date Added: Apr 20, 2005 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 01:48

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