Caractérisation de Protéine Utilisant des Techniques Dynamiques et Statiques de Dispersion de la Lumière des Instruments de Malvern

Sujets Couverts

Mouvement Propre
Dispersion de la Lumière comme Outil de Caractérisation
Dénaturation Thermique
La Structure Quaternaire des Protéines
Totalisation
Distribution de Grandeurs en fonction de Concentration Ionique
MW et Coefficient de Virial
Estimations de Forme
STATION DE POMPAGE HAUTE PRESSION
Spécifications Techniques

Mouvement Propre

La stabilité d'une formulation de protéine à un grand choix de perturbations de solution est critique à sa réussite comme produit pharmaceutique. À cause de la sensibilité de la protéine aux modifications de solution, les techniques invasives de caractérisation peuvent être problématiques. La dispersion de la Lumière est une technique non envahissante qui a reçu l'acceptation large dans la zone de la protéine et de la caractérisation de formulation.

Dispersion de la Lumière comme Outil de Caractérisation

L'intensité de dispersion d'une petite molécule est proportionnelle au carré du poids moléculaire. En soi, les techniques dynamiques et statiques de dispersion de la lumière sont très sensibles au début de la totalisation de protéine résultant des changements subtile des conditions de solution. Le rétablissement D'aujourd'hui de l'instrumentation de dispersion de la lumière comprend les lasers hautement stables, l'optique fibre, les corrélateurs à grande vitesse, et le photon unique comptant les détecteurs qui facilitent la mesure des échantillons de protéine en travers d'un domaine de taille et de concentration qui a jamais avant été réalisable.

Dénaturation Thermique

La structure d'une protéine est stabilisée par un grand nombre de liaisons hydrogènes, d'interactions hydrophobes, et de forces de Van der Waal, qui contribue un petit degré de stabilité à la structure générale. Pendant Que de l'énergie est ajoutée au système par l'intermédiaire d'une augmentation de la température, les forces stabilisantes peuvent être perturbées, permettant à la protéine de dévoiler ou dénaturer. La température à laquelle cette dénaturation se produit est définie pendant que le point de fusion de protéine.

Quand une protéine dénature, les résidus hydrophobes enterrés dans l'intérieur de la structure pliée sont exposés au solvant. Cette condition entropically défavorable est bientôt remplacée cependant, par une où les résidus hydrophobes sur un associé à chaînes de protéine avec ceux sur un autre réseau de protéine. À cause de la dépendance de poids moléculaire de l'intensité de dispersion, cette totalisation non spécifique des protéines dénaturées est facilement surveillée avec l'instrumentation de dispersion de la lumière. Le Schéma 1 affiche une échographie de la température pour l'hémoglobine bovine, et indique de manière dégagée une hausse forte la des deux la taille et intensité de dispersion au point de fusion de 45.5°C.

Le Schéma 1. échographie Thermique pour l'hémoglobine bovine dans 0,13 saline tamponnés aux phosphates de M, indiquant un point de fusion de 45,5 C.

La Structure Quaternaire des Protéines

La structure quaternaire ou la condition commandée d'auto-association d'une protéine peut être influencée par des propriétés de solution telles que le pH et la concentration ionique. La précision des mesures dynamiques de dispersion de la lumière est suffisante pour discerner des changements de structure quaternaire de protéine. Par exemple le Schéma 2 affiche les distributions de grandeurs mesurées pour l'insuline humaine et bovine à pH 2 et à pH 7. À pH 2, les diamètres mesurés pour les deux protéines (voyez que le Tableau 1) sont compatible avec les structures quaternaires dimères, où le poids moléculaire est estimé à partir de la taille empiriquement déterminée contre des relations de masse. À pH 7, les diamètres mesurés sont compatibles avec les formes hexameric connues des protéines au PH physiologique.

Le Schéma 2. distributions de Grandeurs pour l'insuline humaine et bovine à pH 7 et à pH 2, indiquant un changement dépendant du pH de structure quaternaire.

Comparaison du Tableau 1. des valeurs prévues et connues dépendant du pH de poids moléculaire pour l'insuline humaine et bovine.

pH

Diamètre (nanomètre)

Mext (kDa)

Mknown (kDa)

Forme

Humain

2

3,30

10,9

11,4

Dimère

7

5,37

33,9

34,2

Hexamer

Bovin

2

3,47

12,2

-

Dimère

7

5,33

33,4

-

Hexamer

Totalisation

Les additifs de Formulation, tels que des savons et des sels, peuvent avoir une influence prononcée sur la densité de charge extérieure de la protéine et de la concentration ionique de solution. Les variations Subtiles de l'un ou l'autre de ces paramètres peuvent signifier la différence entre une formulation et une totalisation stables d'échantillon. À cause de sa sensibilité aux particules de poids, la dispersion de la lumière dynamique est un outil utile pour surveiller les effets des additifs de formulation sur la totalisation de protéine.

Distribution de Grandeurs en fonction de Concentration Ionique

Le Schéma 3 affiche un transparent de la distribution de grandeurs pour l'albumine de sérum de boeuf en fonction de la concentration ionique au point isoionique de pH 4,8. Pour les concentrations <0.5 M en NaCl, la distribution de grandeurs est monomodal, avec un diamètre hydrodynamique environ de 8,5 nanomètre. Pour les concentrations <0.5M en NaCl, la distribution de grandeurs est multimodale, indiquant la présence de la totalisation de protéine.

Le Schéma 3. distributions de Grandeurs pour l'insuline humaine et bovine à pH 7 et à pH 2, indiquant un changement dépendant du pH de structure quaternaire.

MW et Coefficient de Virial

Pour des petites molécules telles que des protéines, l'échantillon dispersant l'intensité peut être décrit utilisant l'expression de Rayleigh affichée dans l'Équation 1, où K est une constante optique, C est la concentration protéique, R est le rapport de Rayleigh de l'intensité d'analyte à l'intensité d'incident, M est le poids moléculaire moyen d'analyte de grammage, et A est le 2ème coefficient virial.

                        (1)

Comme suggéré dans l'Équation 1, un traçage de KC/R contre C devrait être linéaire, avec une interception équivalente à 1/M et à pente qui est proportionnelle au coefficient 2 virial. Ce type d'analyse unique de poids moléculaire de cornière est connu comme traçage de Debye. Un exemple est donné sur le Schéma 4, qui affiche les traçages de Debye pour le lysozyme dans la solution tampon d'acide acétique de 0,1 M et 0,13 saline tamponnés aux phosphates de M. Les interceptions dans les deux traçages sont compatibles avec le poids moléculaire connu de kDa 14,7. Comme vu sur le Schéma 4 cependant, les 2 coefficients virial dépendent fortement du type de tampon utilisé.

Le Schéma 4. traçages de Debye pour le lysozyme dans la solution tampon d'acide acétique de 0,10 M et 0,13 saline tamponnés aux phosphates de M.

Estimations de Forme

Dans des mesures dynamiques de dispersion de la lumière, la taille hydrodynamique est prévue à partir du coefficient de diffusion mesuré par l'intermédiaire du Charge l'équation d'Einstein, où un modèle de sphère dure est assumé. Des Écarts dans la sphéricité sont réfléchis dans une augmentation de la taille hydrodynamique comparée à la taille prévue pour une sphère dure de poids moléculaire connu. De la théorie de Perrin, la différence en ces deux valeurs, c.-à-d. taille hydrodynamique et la taille de sphère dure, peut être employée pour estimer le paramètre cristallographique pour un ellipsoïde avec les mêmes propriétés diffusionnelles.

Le Schéma 5 affiche une représentation de la structure cristalline pour le lysozyme, et comprend les cotes axiales géométriques. Le cercle rouge est préposé du service de la taille d'une sphère dure hypothétique pour la protéine 14,7 de kDa (volume particulier = 0,73 mL/g). Le cercle vert est préposé du service de la taille hydrodynamique, prévu à partir du coefficient de diffusion mesuré. La différence en valeurs mesurées et théoriques est compatible avec une forme de particules d'ellipsoïde avec un paramètre cristallographique de 1,73, identique au paramètre cristallographique déterminé géométriquement.

Le Schéma 5. Représentation du lysozyme, affichant les cotes axiales géométriques, le diamètre de sphère dure (rouge), le diamètre hydrodynamique (vert), et un ellipsoïde avec les mêmes propriétés diffusionnelles que la protéine (noir).

STATION DE POMPAGE HAUTE PRESSION

La Particule Sizer de Haute Performance (HPPS) des Instruments de Malvern a été particulièrement conçue pour répondre aux besoins faibles de concentration en général associés avec des applications de protéine, avec les conditions de forte concentration pour des applications colloïdales. La Satisfaction de ce seul mélange des conditions faisait par l'intermédiaire de l'intégration d'un design optique rétrodiffusion, et par suite de ce design, les caractéristiques dépassent de loin ceux pour n'importe quel autre instrument dynamique de dispersion de la lumière. Le matériel de STATION DE POMPAGE HAUTE PRESSION est individu optimisant, et le logiciel comprend une seule mesure de « un claquement », analyse, et enregistre la caractéristique technique conçue pour réduire à un minimum la courbe d'apprentissage.

Spécifications Techniques

Paramètre

Caractéristiques

Classe de Grandeur (diamètre)

0.6nm à 6µm

Chaîne de Concentration

0,1 mg/ml Lysozyme au poids/volume de 20%

Volume Témoin

12µL à 2mL

Laser

-Ne, 3.0mW 633nm

Détecteur

Photodiode d'Avalanche

Contrôle de température

10°C à 55°C (à temp 20°C ambiant)

Ensemble Étendu de temp

10°C à 90°C (à temp 20°C ambiant)

Source : « Caractérisation de Protéine Utilisant la Dispersion Légère Dynamique et Statique », Note d'Application par des Instruments de Malvern.

Pour plus d'informations sur cette source visitez s'il vous plaît Malvern Instruments Ltd (R-U) ou les Instruments de Malvern (ETATS-UNIS).

Date Added: Apr 20, 2005 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 01:22

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