La caractérisation des protéines utilisant dynamique et statique des techniques de diffusion de lumière de Malvern Instruments

Thèmes abordés

Contexte
Light Scattering comme un outil de caractérisation
Dénaturation thermique
La structure quaternaire des protéines
L'agrégation
Répartition de la taille en fonction de la force ionique
MW et coefficient du viriel
Les estimations de forme
HPPS
Spécifications techniques

Contexte

La stabilité d'une formulation de protéines à une variété de perturbations solution est essentielle à son succès en tant que produit pharmaceutique. En raison de la sensibilité de la protéine à des changements de solution, les techniques de caractérisation invasive peut être problématique. Diffusion de la lumière est une technique non invasive qui a reçu une large acceptation dans le domaine des protéines et la caractérisation de formulation.

Light Scattering comme un outil de caractérisation

L'intensité de diffusion d'une petite molécule est proportionnelle au carré du poids moléculaire. En tant que tel, dynamiques et statiques des techniques de diffusion de lumière sont très sensibles à l'apparition de l'agrégation des protéines résultant de changements subtils dans les conditions de la solution. La génération actuelle de l'instrumentation comprend la diffusion de lumière laser extrêmement stable, fibre optique, corrélateurs à haute vitesse, et à photon unique de détecteurs de comptage qui facilitent la mesure des échantillons de protéines à travers une gamme de taille et de concentration qui n'a jamais été réalisable.

Dénaturation thermique

La structure d'une protéine est stabilisée par un grand nombre de liaisons hydrogène, des interactions hydrophobes, et forces de Van der Waal, dont chacun contribue dans une faible mesure de la stabilité à la structure globale. Comme l'énergie est ajoutée au système via une augmentation de la température, les forces de stabilisation peut être perturbée, ce qui permet à la protéine de déplier ou dénaturer. La température à laquelle se produit cette dénaturation est défini comme le point de fusion de protéines.

Quand un dénature la protéine, les résidus hydrophobes enfouis à l'intérieur de la structure repliée sont exposés au solvant. Cet état entropique défavorable est bientôt remplacé cependant, avec un procédé dans lequel les résidus hydrophobes sur une chaîne de protéine associée à celles d'une autre chaîne protéique. En raison de la dépendance poids moléculaire de l'intensité de diffusion, cette agrégation non-spécifique de protéines dénaturées est facilement contrôlé avec une instrumentation diffusion de la lumière. La figure 1 montre un balayage de température pour l'hémoglobine bovine, et indique clairement une forte augmentation de la taille et l'intensité de diffusion au point de fusion de 45,5 ° C.

Figure 1. Scan thermique pour l'hémoglobine bovine dans 0,13 M de phosphate saline tamponnée indiquant un point de fusion de 45,5 C.

La structure quaternaire des protéines

La structure quaternaire ou commandés auto-association état d'une protéine peut être influencée par les propriétés solution telle que le pH et la force ionique. La précision des mesures dynamiques de diffusion de lumière est suffisante pour distinguer les changements de la structure protéique quaternaire. Pour 2 Figure exemple montre les distributions de taille mesurée de l'insuline humaine et bovine à pH 2 et pH 7. A pH 2, les diamètres mesurés pour les deux protéines (voir tableau 1) sont compatibles avec dimérique structures quaternaires, où le poids moléculaire est estimé à partir de la taille déterminée de manière empirique vs relations de masse. A pH 7, les diamètres mesurés sont compatibles avec les formes connues hexamérique des protéines à pH physiologique.

Figure 2. Distributions de taille pour l'insuline humaine et bovine à pH 7 et 2, indiquant un changement de pH à charge dans la structure quaternaire.

Tableau 1. Comparaison du pH dépendants calculés et des valeurs connues de poids moléculaire de l'insuline humaine et bovine.

L'agrégation

Des additifs de formulation, tels que des savons et des sels, peuvent avoir une influence marquée sur la densité de charge de surface de la protéine et la solution de force ionique. Des variations subtiles dans un de ces paramètres peut signifier la différence entre une formulation stable et l'agrégation de l'échantillon. En raison de sa sensibilité aux particules de haute masse moléculaire, diffusion de lumière dynamique est un outil utile pour surveiller les effets des additifs de formulation sur l'agrégation des protéines.

Répartition de la taille en fonction de la force ionique

La figure 3 montre une superposition de la distribution de taille pour le sérum albumine bovine en fonction de la force ionique au point isoionic d'un pH de 4,8. Pour des concentrations de NaCl <0,5 M, la distribution de taille est monomodale, avec un diamètre hydrodynamique d'environ 8,5 nm. Pour des concentrations de NaCl <0,5, la distribution de taille est multi-modale, indiquant la présence de l'agrégation des protéines.

Figure 3. Distributions de taille pour l'insuline humaine et bovine à pH 7 et 2, indiquant un changement de pH à charge dans la structure quaternaire.

MW et coefficient du viriel

Pour les petites molécules comme les protéines, l'intensité de diffusion de l'échantillon peut être décrit en utilisant l'expression de Rayleigh montré dans l'équation 1, où K est une constante optique, C est la concentration en protéines, R est le rapport de Rayleigh de l'intensité de l'analyte à l'intensité incidente, M est le poids analyte poids moléculaire moyen, et A est le coefficient du viriel deuxième.

(1)

Comme suggéré dans l'équation 1, une parcelle de KC / R vs C doit être linéaire, avec un équivalent d'interception pour 1 / M et la pente qui est proportionnelle au coefficient 2 viriel. Ce type de simple analyse de poids moléculaire angle est connu comme un complot de Debye. Un exemple est donné dans la figure 4, qui montre les courbes de Debye pour lysozyme dans 0,1 M de tampon acide acétique et 0,13 M de phosphate saline tamponnée. Les interceptions dans les deux parcelles sont compatibles avec le poids moléculaire connu de 14,7 kDa. Comme le montre la figure 4 cependant, les deux coefficients du viriel sont fortement dépendantes du type de tampon utilisé.

Figure 4. Parcelles de Debye pour lysozyme dans 0,10 M de tampon acide acétique et 0,13 M de phosphate saline tamponnée.

Les estimations de forme

Dans la dynamique des mesures de diffusion de lumière, la taille hydrodynamique est calculée à partir du coefficient de diffusion mesuré par l'équation de Stokes-Einstein, où un modèle de sphères dures est supposé. Les écarts dans la sphéricité se reflètent dans l'augmentation de la taille hydrodynamique par rapport à la taille calculée pour une sphère dure de poids moléculaire connu. De la théorie Perrin, la différence de ces deux valeurs, soit la taille hydrodynamique et la taille de sphères dures, peut être utilisé pour estimer le rapport axial pour un ellipsoïde avec les mêmes propriétés diffusionnelles.

La figure 5 montre une représentation de la structure cristalline pour le lysozyme, et inclut les dimensions géométriques axiale. Le cercle rouge est représentatif de la taille d'une sphère hypothétique dur pour la protéine 14,7 kDa (volume spécifique = 0,73 ml / g). Le cercle vert est représentatif de la taille hydrodynamique, calculé à partir du coefficient de diffusion mesuré. La différence entre les valeurs mesurées et théoriques est compatible avec une forme de particule ellipsoïdale avec un rapport axial de 1,73, identique au ratio axiale déterminée géométriquement.

Figure 5. Représentation du lysozyme, montrant les dimensions géométriques axiale, le diamètre de la sphère dure (rouge), le diamètre hydrodynamique (vert), et un ellipsoïde avec les mêmes propriétés que la protéine diffusionnel (noir).

HPPS

Le calibreur de particules de haute performance (HPPS) de Malvern Instruments a été spécialement conçu pour répondre aux exigences faible concentration typiquement associés avec les applications de protéines, ainsi que les exigences de concentration élevé pour des applications colloïdale. La satisfaction de ce mélange unique d'exigences a été réalisée via l'intégration d'une conception de rétrodiffusion optique, et comme une conséquence de cette conception, le cahier des charges dépassent de loin celles de tout autre instrument de lumière dynamiques de diffusion. Le matériel HPPS est l'optimisation de l'auto, et le logiciel comprend un unique «un seul clic" mesurer, analyser, et fonction de rapport conçu pour minimiser la courbe d'apprentissage.

Spécifications techniques

Source: «Caractérisation de protéines utilisant dynamique et statique diffusion de la lumière», Note d'application par Malvern Instruments.

Pour plus d'informations sur cette source s'il vous plaît visitez Malvern Instruments Ltd (Royaume-Uni) ou de Malvern Instruments (Etats-Unis) .