Caratterizzazione delle Proteine Facendo Uso delle Tecniche Leggere Dinamiche & Statiche di Scattering dagli Strumenti di Malvern

Argomenti Coperti

Sfondo
Scattering Leggero come Strumento di Caratterizzazione
Denaturazione Termica
La Struttura Quaternaria delle Proteine
Aggregazione
Distribuzione Per Ampiezza in funzione di Forza Ionica
MW e Coefficiente di Virial
Preventivi di Forma
HPPS
Caratteristiche Tecniche

Sfondo

La stabilità di una formulazione della proteina a varie perturbazioni della soluzione è critica al suo successo come prodotto farmaceutico. A causa della sensibilità della proteina ai cambiamenti della soluzione, le tecniche dilaganti di caratterizzazione possono essere problematiche. Lo scattering Leggero è una tecnica non invadente che ha ricevuto l'ampia accettazione nell'area di proteina e della caratterizzazione di formulazione.

Scattering Leggero come Strumento di Caratterizzazione

L'intensità di scattering di piccola molecola è proporzionale al quadrato del peso molecolare. Come tale, le tecniche leggere dinamiche e statiche di scattering sono molto sensibili all'inizio dell'aggregazione della proteina in seguito ai cambiamenti sottili negli stati della soluzione. L'Odierna generazione di strumentazione leggera di scattering include i laser altamente stabili, le fibre ottiche, i correlatori ad alta velocità ed il singolo fotone che conta i rivelatori che facilitano la misura dei campioni della proteina attraverso un intervallo della dimensione e della concentrazione che mai prima è stata realizzabile.

Denaturazione Termica

La struttura di una proteina è stabilizzata con tantissimi legami idrogeni, interazioni idrofobe e forze di Van der Waal, di cui ciascuno contribuisce un piccolo grado di stabilità alla struttura globale. Mentre l'energia si aggiunge al sistema via un aumento nella temperatura, le forze di stabilizzazione possono essere interrotte, permettendo che la proteina spieghi o denaturi. La temperatura a cui questa denaturazione si presenta è definita come il punto di fusione della proteina.

Quando una proteina denatura, i residui idrofobi sepolti all'interno dell'interno della struttura profilatura sono esposti al solvente. Questo stato entropically sfavorevole presto è sostituito tuttavia, con uno in cui i residui idrofobi su un socio a catena della proteina con quelle su un'altra catena della proteina. A causa della dipendenza del peso molecolare dell'intensità di scattering, questa aggregazione non specifica delle proteine denaturate è riflessa facilmente con strumentazione leggera di scattering. Figura 1 mostra una scansione della temperatura per emoglobina bovina e chiaramente indica un aumento importante sia nella dimensione che nell'intensità di scattering al punto di fusione di 45.5°C.

Figura 1. scansione Termica per emoglobina bovina in salino tamponato con i fosfati di 0,13 M., indicante un punto di fusione di 45,5 C.

La Struttura Quaternaria delle Proteine

La struttura quaternaria o lo stato ordinato dell'autoassociazione di una proteina può essere influenzato dai beni della soluzione quali il pH e la forza ionica. La precisione delle misure leggere dinamiche di scattering è sufficiente per distinguere i cambiamenti in struttura quaternaria della proteina. Per esempio Figura 2 mostra le distribuzioni per ampiezza misurate per insulina umana e bovina a pH 2 ed a pH 7. A pH 2, i diametri misurati per entrambe le proteine (vedi che la Tabella 1) è coerente con le strutture quaternarie dimere, in cui il peso molecolare è stimato dalla dimensione empiricamente risoluta contro le relazioni di massa. A pH 7, i diametri misurati sono coerenti con i moduli hexameric conosciuti delle proteine a pH fisiologico.

Figura 2. distribuzioni per ampiezza Per insulina umana e bovina a pH 7 ed a pH 2, indicanti un cambiamento dipendente dal pH in struttura quaternaria.

Confronto della Tabella 1. dei valori calcolati e conosciuti dipendenti dal pH del peso molecolare per insulina umana e bovina.

pH

Diametro (nanometro)

M.ext (kDa)

M.known (kDa)

Modulo

Umano

2

3,30

10,9

11,4

Dimero

7

5,37

33,9

34,2

Hexamer

Bovino

2

3,47

12,2

-

Dimero

7

5,33

33,4

-

Hexamer

Aggregazione

Gli additivi di Formulazione, quali i saponi ed i sali, possono avere un'influenza pronunciata sulla densità di carica di superficie della proteina e della forza ionica della soluzione. Le variazioni Sottili nell'uno o l'altro di questi parametri possono significare la differenza fra una formulazione e un'aggregazione stabili del campione. A causa della sua sensibilità alle particelle di alto peso molecolare, lo scattering leggero dinamico è uno strumento utile per il video degli effetti degli additivi di formulazione sull'aggregazione della proteina.

Distribuzione Per Ampiezza in funzione di Forza Ionica

Figura 3 mostra un foglio di prova della distribuzione per ampiezza per l'albumina di siero bovino in funzione di forza ionica al punto isotonico di pH 4,8. Per le concentrazioni <0.5 M. nel NaCl, la distribuzione per ampiezza è monomodal, con un diametro idrodinamico di circa 8,5 nanometro. Per le concentrazioni <0.5M nel NaCl, la distribuzione per ampiezza è multimodale, indicando la presenza di aggregazione della proteina.

Figura 3. distribuzioni per ampiezza Per insulina umana e bovina a pH 7 ed a pH 2, indicanti un cambiamento dipendente dal pH in struttura quaternaria.

MW e Coefficiente di Virial

Per le piccole molecole quali le proteine, l'intensità di scattering del campione può essere descritta facendo uso dell'espressione di Rayleigh indicata nell'Equazione 1, dove il K è una costante ottica, C è la concentrazione nella proteina, la R è il rapporto di Rayleigh dell'intensità dell'analito all'intensità di incidente, la M. è il peso molecolare medio dell'analito del peso ed A è il secondo coefficiente virial.

                        (1)

Come suggerito nell'Equazione 1, un tracciato di KC/R contro la C dovrebbe essere lineare, con un'intercettazione equivalente a 1/M ed al pendio che è proporzionale al coefficiente virial 2. Questo tipo di singola analisi del peso molecolare di angolo è conosciuto come tracciato di Debye. Un esempio si arrende Figura 4, che mostra i diagrammi di Debye per lisozima nella soluzione tampone dell'acido acetico da 0,1 M. ed in salino tamponato con i fosfati di 0,13 M. Le intercettazioni in entrambi i tracciati sono coerenti con il peso molecolare conosciuto del kDa 14,7. Come si vede in Figura 4 tuttavia, i 2 coefficienti virial dipendono forte dal tipo di buffer usato.

Figura 4. tracciati di Debye per lisozima nella soluzione tampone dell'acido acetico da 0,10 M. ed in salino tamponato con i fosfati di 0,13 M.

Preventivi di Forma

Nelle misure leggere dinamiche di scattering, la dimensione idrodinamica è calcolata dal coefficiente di diffusione misurato via Rifornisce l'equazione di Einstein, dove un modello della sfera dura è presupposto. Le Deviazioni nella sfericità sono riflesse in un aumento nella dimensione idrodinamica confrontata alla dimensione calcolata per una sfera dura di peso molecolare conosciuto. Dalla teoria di Perrin, la differenza in questi due valori, cioè dimensione idrodinamica e la dimensione della sfera dura, può essere usata per stimare il rapporto assiale per un'elissoide con gli stessi beni diffusionali.

Figura 5 mostra una rappresentazione del sistema cristallino per lisozima e comprende le dimensioni assiali geometriche. Il cerchio rosso è rappresentante della dimensione di una sfera dura ipotetica per la proteina 14,7 di kDa (volume specifico = 0,73 mL/g). Il cerchio verde è rappresentante della dimensione idrodinamica, calcolato dal coefficiente di diffusione misurato. La differenza nei valori misurati e teorici è coerente con una forma della particella dell'elissoide con un rapporto assiale di 1,73, identico al rapporto assiale determinato geometricamente.

Figura 5. Rappresentazione di lisozima, mostrante le dimensioni assiali geometriche, il diametro della sfera dura (rosso), diametro idrodinamico (verde) e un'elissoide con gli stessi beni diffusionali della proteina (il nero).

HPPS

La Particella Sizer di Rendimento Elevato (HPPS) Dagli Strumenti di Malvern specificamente è stata destinata per soddisfare le richieste basse di concentrazione connesse tipicamente con le applicazioni della proteina, con i requisiti di alta concentrazione delle applicazioni colloidali. La Soddisfazione della questa miscela unica dei requisiti faceva via l'integrazione di una progettazione ottica di backscatter ed in conseguenza di questa progettazione, le specifiche lontano superano quelle per qualunque altro strumento leggero dinamico di scattering. Il hardware del HPPS è auto che ottimizza ed il software comprende “una misura unica di un clic„, analizza e riferisce la funzionalità destinata per minimizzare la curva di apprendimento.

Caratteristiche Tecniche

Parametro

Specifiche

Intervallo di Grandezza (diametro)

0.6nm a 6µm

Intervallo di Concentrazione

0,1 mg/ml Lisozima a p/V di 20%

Volume di Campione

12µL a 2mL

Laser

Lui-Ne, 3.0mW 633nm

Rivelatore

Fotodiodo della Valanga

Controllo della temperatura

10°C a 55°C (agli impiegati ambientali 20°C)

Unità temporanea Estesa

10°C a 90°C (agli impiegati ambientali 20°C)

Sorgente: “Caratterizzazione delle Proteine Facendo Uso dello Spargimento Leggero Dinamico & Statico„, Nota di Applicazione dagli Strumenti di Malvern.

Per ulteriori informazioni su questa sorgente visualizzi prego Strumenti la Srl (REGNO UNITO) di Malvern o gli Strumenti di Malvern (U.S.A.).

Date Added: Apr 20, 2005 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 01:28

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