נושאים שידונו
רקע
פיזור אור ככלי אפיון
תרמי denaturation
מבנה הרביעון של חלבונים
צבירת
גודל הפצה כפונקציה של כוח יונית
MW ו מקדם Virial
צורה אומדנים
HPPS
מפרט טכני
רקע
היציבות של ניסוח חלבון למגוון הפרעות הפתרון הוא קריטי להצלחתה כמוצר התרופות. בגלל הרגישות של החלבון לשינויים פתרון, טכניקות אפיון פולשנית יכולה להיות בעייתית. פיזור האור היא טכניקה לא פולשנית, כי קיבלה הסכמה רחבה בתחום אפיון חלבונים ניסוח.
פיזור אור ככלי אפיון
עוצמת פיזור של מולקולה קטנה פרופורציונלי לריבוע משקל מולקולרי. ככזה, דינמי סטטי טכניקות פיזור אור רגישים מאוד תחילת צבירת חלבון הנובעים שינויים עדינים התנאים פתרון. הדור של היום של מכשור כולל פיזור אור לייזר יציבה מאוד, סיבים אופטיים, correlators מהירות גבוהה, ספירת פוטון יחיד גלאי המאפשרים מדידה של דגימות חלבון על פני טווח של גודל וריכוז כי מעולם לא היה לפני השגה.
תרמי denaturation
המבנה של חלבון הוא התייצב על ידי מספר גדול של קשרי מימן, אינטראקציות הידרופוביות, וכן כוחות ואן דר ואל, שכל אחד מהם תורם מידה קטן של יציבות למבנה הכללי. כמו אנרגיה נוסף למערכת באמצעות עלייה בטמפרטורה, כוחות לייצוב ניתן שיבשו, המאפשר החלבון להתגלות או לפגל. בטמפרטורה שבה denaturation זו מתרחשת מוגדרת נקודת התכה חלבון.
כאשר denatures חלבון, שאריות הידרופובי קבור בתוך הפנים של המבנה המקופל נחשפים הממס. מצב זה שלילי entropically מוחלף בקרוב עם זאת, עם אחד שבו שאריות הידרופובי על לשייך חלבון אחד שרשרת עם אלה על שרשרת חלבון אחר. בגלל התלות משקל מולקולרי של עוצמת פיזור, צבירה זו הלא ספציפית של חלבונים מפוגל מנוטר בקלות עם מכשור פיזור אור. איור 1 מציג סריקה טמפרטורה עבור המוגלובין שור, ועל מצביע בבירור על עלייה חדה גודל וגם עוצמת פיזור בנקודת ההיתוך של 45.5 ° C.
באיור 1. סריקה תרמית ההמוגלובין שור ב פוספט M 0.13 שנאגרו מלוחים, המציין נקודת התכה של 45.5 ג
מבנה הרביעון של חלבונים
מבנה הרביעון או הורה עצמית העמותה המדינה של חלבון עשוי להיות מושפע המאפיינים פתרון כגון ה-pH לבין כוח יוניים. הדיוק של מדידות פיזור אור דינאמי מספיק כדי להבחין בשינויים במבנה חלבון הרביעון. דוגמה עבור איור 2 מציג את התפלגות גודל נמדד אינסולין אנושי שור ב-pH 2 ו-pH 7. ב-pH 2, בקטרים נמדד עבור שני חלבונים (ראה לוח 1) עולים בקנה אחד עם מבנים הרביעון dimeric, שם משקל מולקולרי נאמד גודל נקבעים אמפירית לעומת יחסים המונית. ב-pH 7, בקטרים נמדד עולות בקנה אחד עם צורות hexameric ידוע של חלבונים ב-pH הפיזיולוגי.
איור 2. הפצות גודל של אינסולין אנושי שור ב-pH 7 ו-pH 2, מה שמעיד על שינוי pH תלויה במבנה הרביעון.
טבלה 1. השוואה של ה-pH התלוי מחושב ידוע ערכי משקל מולקולרי של אינסולין אנושי שור.
| | | | | |
אנושי | 2 | 3.30 | 10.9 | 11.4 | Dimer |
| 7 | 5.37 | 33.9 | 34.2 | Hexamer |
דמוי שור | 2 | 3.47 | 12.2 | - | Dimer |
| 7 | 5.33 | 33.4 | - | Hexamer |
צבירת
תוספים גיבוש, כגון סבונים ומלחים, יכול להיות בעל השפעה בולטת על פני השטח בצפיפות מטען של החלבון ואת הכוח יוניים פתרון. שינויים קלים בשני פרמטרים אלה יכולים להיות ההבדל בין ניסוח יציב צבירה המדגם. בגלל רגישותו הגבוהה חלקיקים בעלי משקל מולקולרי, פיזור אור דינאמי הוא כלי שימושי עבור ניטור ההשפעות של תוספים ניסוח על צבירת חלבון.
גודל הפצה כפונקציה של כוח יונית
איור 3 מראה כיסוי של התפלגות גודל של אלבומין בסרום שור כפונקציה של כוח יוניים בנקודת isoionic של pH 4.8. עבור ריכוזי NaCl <0.5 מ ', חלוקת גודל monomodal, בקוטר הידרודינמית של כ 8.5 ננומטר. עבור ריכוזי NaCl <0.5m, התפלגות גודל הוא רב מודאלית, המעידים על נוכחות של צבירת חלבון.
איור 3. הפצות גודל של אינסולין אנושי שור ב-pH 7 ו-pH 2, מה שמעיד על שינוי pH תלויה במבנה הרביעון.
MW ו מקדם Virial
עבור מולקולות קטנות, כגון חלבונים, עוצמת פיזור מדגם ניתן לתאר באמצעות ביטוי ריילי שמוצג במשוואה 1, שם K הוא קבוע אופטי, C הוא ריכוז חלבון, R הוא היחס של ריילי עוצמת אנליטי עוצמת האירוע, M הוא הממוצע משקל אנליטי משקל מולקולרי, וכן הוא מקדם virial 2.
(1)
הציע כמו משוואה 1, חלקת KC / R לעומת C צריך להיות ליניארי, עם מקבילה כדי ליירט ז / 1 ו מדרון כי הוא יחסי מקדם 2 virial. סוג זה של ניתוח זווית משקל מולקולרי יחיד המכונה מגרש דביי. דוגמה ניתנת בתרשים 4, אשר מציג את חלקות דביי עבור ליזוזים במאגר M 0.1 חומצה אצטית ו - 0.13 פוספט M שנאגרו מלוחים. מיירט בחלקות הן עולות בקנה אחד עם משקל מולקולרי ידוע של 14.7 kDa. כפי שניתן לראות באיור 4 עם זאת, 2 מקדמי virial תלויים מאוד על סוג של חיץ בשימוש.
איור 4. חלקות דביי עבור ליזוזים במאגר M 0.10 חומצה אצטית ו - 0.13 פוספט M שנאגרו מלוחים.
צורה אומדנים
ב מדידות פיזור אור דינאמי, גודל הידרודינמית מחושב מקדם הדיפוזיה נמדדת באמצעות משוואת סטוקס איינשטיין, שבו מודל כדור קשה להניח. סטיות של הכדוריות משתקפים גידול בגודל הידרודינמית בהשוואה לגודל מחושב על כדור קשה של משקל מולקולרי ידוע. מתוך התיאוריה פרין, ההבדל בין שני הערכים, כלומר גודל הידרודינמית ואת גודל כדור חזק, יכול לשמש כדי להעריך את יחס צירית עבור אליפסואיד עם מאפיינים diffusional אותו.
איור 5 מראה ייצוג של המבנה הגבישי של ליזוזים, והוא כולל את הממדים צירית גיאומטריות. עיגול אדום הוא נציג של בגודל של כדור קשה היפותטי של חלבון 14.7 kDa (נפח מסוים = 0.73 mL / g). המעגל הירוק הוא נציג של גודל הידרודינמית, מחושב מקדם הדיפוזיה נמדד. ההבדל הערכים שנמדדו תיאורטי עולה בקנה אחד עם צורת החלקיקים אליפסה עם יחס של 1.73 צירית, זהה ליחס צירית נקבע גאומטרית.
איור 5. ייצוג ליזוזים, מראה את הממדים צירית גיאומטריות, קוטר כדור קשה (אדום), בקוטר הידרודינמית (ירוק), אליפסואיד עם מאפיינים diffusional כמו חלבון (שחור).
HPPS
ביצועים גבוהים של חלקיקים סייזר (HPPS) מ Malvern מכשירים תוכנן במיוחד כדי לעמוד בדרישות ריכוז נמוך הקשורות בדרך כלל עם יישומים החלבון, יחד עם דרישות ריכוז גבוה עבור יישומים colloidal. קיום דרישות סעיף זה שילוב ייחודי של דרישות הושגה באמצעות שילוב של עיצוב backscatter אופטי, וכתוצאה מכך של העיצוב הזה, מפרטים בהרבה מאלו של כל מכשיר אחר פיזור אור דינאמי. החומרה HPPS הוא אופטימיזציה עצמית, התוכנה כוללת ייחודית "קליק אחד" למדוד, לנתח תכונה הדו"ח נועד למזער את עקומת למידה.
מפרט טכני
מקור: "אפיון חלבון באמצעות פיזור אור דינאמי & Static", הערה בקשה על ידי Malvern מכשירים.
לקבלת מידע נוסף על מקור זה בקר Malvern מכשירים בע"מ (בריטניה) או Malvern מכשירים (ארה"ב) .