Malvern の器械からのダイナミックで及び静的な光散乱の技術を使用して蛋白質の性格描写

カバーされるトピック

背景
性格描写のツールとして光散乱
熱変性
蛋白質の四次構造
集合
イオン強さの機能としてサイズ分布
MW および Virial 係数
形の推定値
HPPS
技術仕様

背景

いろいろな解決の摂動への蛋白質の公式の安定性は医薬品として成功に重大です。 解決の変更への蛋白質の感度のために、侵略的な性格描写の技術は問題となります。 光散乱は蛋白質および公式の性格描写の領域の広い受諾を受け取った非侵襲的な技術です。

性格描写のツールとして光散乱

小さい分子の分散の強度は分子量の正方形に比例しています。 したがって、ダイナミックで、静的な光散乱の技術は解決の状態の微妙な変更から起こる蛋白質の集合の手始めに非常に敏感です。 光散乱の器械使用の今日の生成は非常に安定したレーザー、ファイバ・オプティックス、高速 correlators およびずっと今までに一度も達成可能ではないサイズおよび集中の範囲を渡る蛋白質のサンプルの測定を促進する探知器を数える単一の光子を含んでいます。

熱変性

蛋白質の構造はそれぞれが全面的な構造に小さい程度の安定性を貢献するヴァン多数の水素結合、疎水性相互作用および der Waal 力によって安定します。 エネルギーが温度の増加によってシステムに追加されると同時に、安定力は破壊することができま開くか、または変化するように蛋白質がします。 この変性が発生する温度は蛋白質の融点と定義されます。

蛋白質が変化するとき、折られた構造の内部の内で埋められる疎水性残余は溶媒 -- にさらされます。 この entropically 好ましくない状態は 1 つとすぐにしかし、別の蛋白質の鎖のそれらの 1 蛋白質のチェーン仲間の疎水性残余取り替えられます。 分散の強度の分子量の依存のために、変化させた蛋白質のこの無指定の集合は光散乱の器械使用と容易に監視されます。 図 1 は牛のようなヘモグロビンのための温度スキャンを示し、はっきりサイズの急増をおよび強度 45.5°C. の融点の分散の明記します。

0.13 M の隣酸塩の牛のようなヘモグロビンのための図 1. 熱スキャンは塩を緩衝しま、 45.5 C. の融点を明記します。

蛋白質の四次構造

蛋白質の四次構造か発注された自己連合の状態は pH およびイオン強さのような解決の特性によって影響を及ぼすことができます。 ダイナミックな光散乱の測定の精密は蛋白質の四次構造の変更を区別して十分です。 例えば図 2 は pH 2 および pH 7. で人間および牛のようなインシュリンのための測定されたサイズ分布を示します。 pH 2、表 1) が分子量が経験的に断固としたなサイズから対多く関係推定される二量体の四次構造に一貫していることを両方の蛋白質のための測定された直径 (見て下さい。 pH 7 で、測定された直径は生理学的な PH. で蛋白質の知られていた hexameric 形式に一貫しています。

四次構造の pH の依存した変更を明記する pH 7 および pH 2 の人間および牛のようなインシュリンのための図 2. サイズ分布。

人間および牛のようなインシュリンのための pH の扶養家族計算され、知られていた分子量値の表 1. の比較。

pH

Dia (nm)

Mext (kDa)

Mknown (kDa)

形式

人間

2

3.30

10.9

11.4

二量体

7

5.37

33.9

34.2

Hexamer

牛のよう

2

3.47

12.2

-

二量体

7

5.33

33.4

-

Hexamer

集合

公式の添加物は、石鹸および塩のような、蛋白質および解決のイオン強さの面電荷密度の顕著な影響があることができます。 これらのパラメータのどちらかの微妙な変化は安定した公式とサンプル集合の違いを意味できます。 高分子量の粒子への感度のために、ダイナミックな光散乱は蛋白質の集合に対する公式の添加物の効果を監視するための役に立つツールです。

イオン強さの機能としてサイズ分布

図 3 は pH 4.8 の isoionic ポイントでイオン強さの機能として牛のようなアルブミンのためのサイズ分布のオーバーレイを示します。 NaCl の集中 <0.5 M のために、サイズ分布は約 8.5 nm の流体力学の直径と monomodal、です。 NaCl の集中 <0.5M のために、サイズ分布は複数の形態上で、蛋白質の集合の存在を明記します。

四次構造の pH の依存した変更を明記する pH 7 および pH 2 の人間および牛のようなインシュリンのための図 3. サイズ分布。

MW および Virial 係数

蛋白質のような小さい分子のために、強度を分散させるサンプルは同等化 1 で示されている Rayleigh の表現を使用して K が光学定数であるところに、 C です蛋白質の集中記述することができます、 R は事件の強度への analyte の強度の Rayleigh の比率です、 M は重量平均の analyte の分子量であり、 A は第 2 virial 係数です。

                        (1)

同等化 1 で提案のとおりに、 KC/R のプロットは対 C 2 virial 係数に比例している 1/M および斜面と同等の妨害と線形、べきです。 このタイプの単一の角度の分子量の分析は Debye のプロットとして知られています。 例は 0.1 M の酢酸バッファおよび 0.13 M のリン酸緩衝液塩でリゾチームのための Debye のプロットを示す図 4 に示されています。 両方のプロットの妨害は 14.7 の kDa の知られていた分子量に一貫しています。 しかし図 4 に見られるように、 2 つの virial 係数は使用されるバッファの種類に強く依存しています。

0.10 M の酢酸バッファおよび 0.13 M のリン酸緩衝液塩のリゾチームのための図 4. Debye のプロット。

形の推定値

ダイナミックな光散乱の測定では、流体力学のサイズはによって測定された拡散係数からかき立てます堅い球モデルが仮定される Einstein の同等化を計算されます。 球形の偏差は知られていた分子量の堅い球のために計算されるサイズと比較される流体力学のサイズの増加に反映されます。 Perrin 理論から同じ diffusional 特性が付いている楕円体のための軸比率を推定するのに、これら二つの値、すなわち流体力学のサイズおよび堅い球のサイズの相違が、使用することができます。

図 5 はリゾチームのための結晶構造の表示を示し、幾何学的な軸次元を含んでいます。 赤い円は 14.7 の kDa 蛋白質のための仮説的で堅い球のサイズの代表です (特定のボリューム = 0.73 mL/g)。 緑の円は測定された拡散係数から計算される流体力学のサイズの代表です。 測定され、理論的な値の相違は幾何学的に定められる軸比率と同一の 1.73 の軸比率の楕円体の粒子の形に一貫しています。

蛋白質 (黒) と幾何学的な軸次元、堅い球の直径 (赤い)、流体力学の直径 (緑)、および同じ diffusional 特性が付いている楕円体を示すリゾチームの図 5. 表示。

HPPS

Malvern の器械からの (HPPS)高性能の粒子 Sizer はとりわけ普通コロイドアプリケーションのための高い濃度の条件と共に蛋白質のアプリケーションと、関連付けられた低い集中の条件を満たすように設計されていました。 条件のこの一義的な組合せを満たすことは後方散乱の光学デザインの統合によって堪能であり、このデザインの結果として、指定はずっと他のどのダイナミックな光散乱の器械のためのもそれらを超過します。 HPPS のハードウェアは最適化している自己でありソフトウェアは一義的な 「1 つのクリック」の測定を含み、分析し、そして習熟曲線を最小化するように設計されている機能を報告します。

技術仕様

パラメータ

指定

サイズの範囲 (直径)

6µm への 0.6nm

集中範囲

20% w/v への 0.1 mg/mL リゾチーム

サンプルボリューム

12µL への 2mL

レーザー

彼 Ne、 3.0mW 633nm

探知器

なだれフォトダイオード

温度調整

10°C への 55°C (20°C 包囲された臨時雇用者で)

拡張臨時雇用者の単位

10°C への 90°C (20°C 包囲された臨時雇用者で)

ソース: 「ダイナミックで及び静的で軽い分散を使用して蛋白質性格描写」の、 Malvern の器械によるアプリケーションノート。

このソースのより多くの情報のために Malvern の器械株式会社 (イギリス) または Malvern の器械 (米国) を訪問して下さい。

Date Added: Apr 20, 2005 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 01:30

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit