トピックがカバー
背景
特性評価ツールとしての光散乱
熱変性
タンパク質の四次構造
集約
イオン強度の関数としてのサイズ分布
MWとビリアル係数
形状の推定
HPPS
技術仕様
背景
解の摂動の様々なタンパク質製剤の安定性は、医薬品としての成功に不可欠です。ために解の変化へのタンパク質の感度が、侵襲的特性評価技術は、問題となる可能性があります。光散乱は、蛋白質及び製剤の特性評価の分野で広く受け入れを受信した非侵襲的方法である。
特性評価ツールとしての光散乱
小分子の散乱強度は、分子量の二乗に比例する。このように、動的および静的光散乱法は溶液条件の微妙な変化から生じるタンパク質の凝集の開始に非常に敏感です。光散乱計測の今日の世代は非常に安定したレーザー、光ファイバー、高速相関器、及び大きさと前に達成されたことがない濃度の範囲にわたってタンパク質サンプルの測定を容易にする単一光子計数検出器が含まれています。
熱変性
タンパク質の構造は、全体的な構造に安定度が小さいに寄与するそれぞれの水素結合、疎水性相互作用、及びファンデルワールス力、多数のによって安定化される。エネルギーは温度の上昇を介してシステムに追加されると、安定力はタンパク質が展開または変性することができます、破砕することができる。この変性が起こる温度は、タンパク質の融点として定義されています。
するときにタンパク質の変性、折り畳み構造の内部に埋もれて疎水性残基が溶媒に露出している。このエントロピー不利な状態はすぐにお互いのタンパク質鎖のそれらと一つのタンパク質の鎖の準上の疎水性残基を特徴と、しかし、置き換えられます。ために散乱強度の分子量依存性から、変性タンパク質のこの非特異的凝集を容易に光散乱の計測と監視されます。図1は、ウシヘモグロビンの温度スキャンを示しており、明らかに45.5の融点でのサイズと散乱強度の両方の急激な増加を示し℃に
図1 0.13 Mリン酸のウシヘモグロビンのサーマルスキャンは45.5℃の融点を示す、緩衝生理食塩水
タンパク質の四次構造
四次構造やタンパク質の自己会合状態をpHやイオン強度などの溶液物性の影響を受けることができます命じた。動的光散乱測定の精度は、タンパク質の四次構造の変化を区別するのに十分です。例えば、図2はpH 2とpH 7でヒトおよびウシインスリンの測定粒径分布を示しています。 pHが2で、両方のタンパク質（表1参照）のための測定された直径は分子量が経験的に決定サイズと質量の関係から推定される二量体の四次構造、と一致している。 pH7では、測定された直径は生理的pHでのタンパク質の既知量体の形態と一致している。
図2サイズpHを7とpH 2でのヒトおよびウシインスリンのためのディストリビューションで、四次構造のpH依存性の変化を示す。
表1。ヒトおよびウシインスリンに対して計算し、分子量の値を既知の依存pHの比較。
| 7 | 5.33 | 33.4 | - | 六量体 |
集約
そのような石鹸や塩などの製剤添加剤は、タンパク質の表面電荷密度およびソリューションのイオン強度に顕著な影響を持つことができます。これらのパラメータのいずれかの微妙な変化は、安定な製剤とサンプルの凝集の違いを意味することができます。高分子量の粒子に対する感度のため、動的光散乱は、蛋白質の凝集に対する製剤の添加剤の効果を監視するための便利なツールです。
イオン強度の関数としてのサイズ分布
図3は、pH 4.8の等イオン点におけるイオン強度の関数としてウシ血清アルブミンのサイズ分布のオーバーレイを示しています。 NaCl濃度<0.5 Mの場合は、サイズ分布は約8.5 nmの流体力学的直径で、単峰性である。 <0.5MのNaCl濃度の場合は、サイズ分布は、タンパク質の凝集の存在を示す、マルチモーダルです。
図3。サイズpHを7とpH 2でのヒトおよびウシインスリンのためのディストリビューションで、四次構造のpH依存性の変化を示す。
MWとビリアル係数
タンパク質などの小分子の場合は、サンプルの散乱強度は、Kは光学定数である式1に示すようにレイリーの式を使用して記述できる、Cはタンパク質濃度であり、Rは、入射強度の分析物の強度のレイリー比です。 Mは、重量平均検体分子量であり、第2ビリアル係数である。
（1）
式1に提案、KC / RとCのプロットは、1 / Mと2ビリアル係数に比例する傾きと切片と同等で、リニアでなければなりません。単一の角度分子量のこのタイプの分析は、デバイプロットとして知られています。例は、0.1 M酢酸緩衝液、0.13 Mリン酸のリゾチームにおけるDebyeプロットを示す図4で与えられている緩衝生理食塩水。両方のプロットの傍受は、14.7 kDaの既知の分子量と一致している。しかし、図4に示すように、2ビリアル係数が使用されるバッファのタイプに強く依存しています。
図4。0.10 M酢酸緩衝液、0.13 Mリン酸におけるリゾチームにおけるDebyeプロット緩衝生理食塩水。
形状の推定
動的光散乱測定では、流体力学的サイズは、剛体球モデルが想定されるStokes - Einsteinの式、を介して測定された拡散係数から計算されます。真球度の偏差が既知の分子量の剛体球のために計算されたサイズに比べて流体力学的サイズの増加に反映されます。ペランの理論から、これら二つの値の差、すなわち流体力学的サイズと剛体球のサイズは、同一の拡散特性を持つ楕円体のために軸比を推定するために使用することができます。
図5は、リゾチームの結晶構造の表現を示し、幾何学的な軸方向の寸法が含まれています。赤い円は、14.7 kDaの蛋白質のための仮想的な剛体球（特定のボリューム= 0.73 ML / g）の大きさを表している。緑色の丸は、測定された拡散係数から計算流体力学的サイズの代表的な、です。測定値と理論値の差は、幾何学的に決定した軸比と同一の、1.73の軸比を持つ楕円体粒子の形状と一致している。
図5。リゾチームの表現、幾何学的な軸方向の寸法、剛体球の直径（赤）、流体力学的直径（緑）、および蛋白質（黒）と同じ拡散特性を持つ楕円を示す。
HPPS
より高性能粒子サイザー（HPPS） マルバーンは、特にコロイドのアプリケーションのための高濃度の要件と共に、一般的にタンパク質のアプリケーションに関連付けられている低濃度の要件を満たすように設計された。要件のこのユニークな組み合わせを満たすことは後方散乱光学設計の統合によって実現し、この設計の結果として、仕様がまだ他の動的光散乱装置のためのそれらを超えていた。 HPPSのハードウェアは、自己最適化であり、ソフトウェアはユニークな"ワンクリック"測定、分析、および学習曲線を最小限にするために設計されたレポート機能が含まれています。
技術仕様
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サイズの範囲（直径） | 0.6N ・ mの量6μm |
濃度範囲 | は0.1 mg / mLのリゾチーム〜20％w / vの |
サンプルボリューム | 12μLに2mLの |
レーザー | のHe - Ne、3.0mW 633nm |
検出 | アバランシェフォトダイオード |
温度制御 | 10℃〜55℃（20℃の周囲温度） |
拡張された動作温度単位 | 10 ° C〜90 ° C（20 ° Cの周囲温度）
Date Added: Apr 20, 2005
Last Update: 10. October 2011 15:54
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