Besproken onderwerpen
Achtergrond
Lichtverstrooiing als een Karakterisering Tool
Thermische denaturatie
De quaternaire structuur van eiwitten
Aggregatie
Size Distribution als functie van ionensterkte
MW en viriaal Coefficient
Schattingen vorm
HPPS
Technische specificaties
Achtergrond
De stabiliteit van een eiwit formulering om een verscheidenheid van de oplossing verstoringen is cruciaal voor het succes als een farmaceutisch product. Vanwege de gevoeligheid van het eiwit aan oplossing verandert, kan invasieve karakterisatie technieken problematisch zijn. Lichtverstrooiing is een niet-invasieve techniek die brede acceptatie heeft gekregen op het gebied van eiwitten en formulering karakterisering.
Lichtverstrooiing als een Karakterisering Tool
De verstrooiing intensiteit van een klein molecuul is evenredig met het kwadraat van het molecuulgewicht. Als zodanig, dynamische en statische lichtverstrooiing technieken zijn zeer gevoelig voor het ontstaan van eiwitaggregatie als gevolg van subtiele veranderingen in de oplossing omstandigheden. De huidige generatie van lichtverstrooiing instrumentatie bestaat uit zeer stabiele lasers, glasvezel, hoge snelheid correlatoren, en single photon tellen detectoren die de meting van de proteïne monsters te vergemakkelijken in een heel scala van grootte en concentratie die nog nooit eerder is bereikt.
Thermische denaturatie
De structuur van een eiwit wordt gestabiliseerd door een groot aantal van waterstofbruggen, hydrofobe interacties, en Van der Waal krachten, die elk een kleine mate van stabiliteit draagt bij aan de algemene structuur. Als energie wordt toegevoegd aan het systeem via een verhoging van de temperatuur, kan de stabiliserende krachten worden verstoord, waardoor het eiwit te ontvouwen of denatureren. De temperatuur waarbij dit denaturatie optreedt is gedefinieerd als het eiwit smeltpunt.
Wanneer een eiwit denatureert, zijn de hydrofobe resten begraven in het interieur van de gevouwen structuur blootgesteld aan het oplosmiddel. Deze entropically ongunstige toestand wordt echter snel vervangen, met een waarin de hydrofobe residuen op een eiwitketen associëren met die op een ander eiwit keten. Omwille van het molecuulgewicht afhankelijk van de intensiteit van verstrooiing, is deze niet-specifieke aggregatie van gedenatureerde eiwitten gemakkelijk worden gecontroleerd met lichtverstrooiing instrumentatie. Figuur 1 toont een temperatuur scan voor runderen hemoglobine, en geeft duidelijk aan een sterke toename van zowel de grootte en de verstrooiing intensiteit op het smeltpunt van 45,5 ° C.
Figuur 1. Thermische scan voor runderen hemoglobine in 0,13 M fosfaat gebufferde zoutoplossing, wat wijst op een smeltpunt van 45,5 C.
De quaternaire structuur van eiwitten
De quaternaire structuur of besteld zelfassociatie toestand van een eiwit kan worden beïnvloed door oplossing eigenschappen zoals de pH en de ionische sterkte. De precisie van dynamische lichtverstrooiing metingen is voldoende om veranderingen in eiwit quaternaire structuur te onderscheiden. Bijvoorbeeld Figuur 2 toont de gemeten grootte distributies voor mens en rund insuline bij pH 2 en pH 7. Bij pH 2, de gemeten diameters voor zowel eiwitten (zie tabel 1) zijn in overeenstemming met dimeer quaternaire structuren, waar het moleculair gewicht is geschat op basis van empirisch bepaalde grootte ten opzichte van de massa relaties. Bij pH 7, de gemeten diameters komen overeen met de bekende hexamere vormen van de eiwitten die bij fysiologische pH.
Figuur 2. Size distributies voor mens en rund insuline bij pH 7 en pH 2, wat wijst op een pH-afhankelijke verandering in de quaternaire structuur.
Tabel 1. Vergelijking van de pH-afhankelijke berekend en bekende waarden voor het molecuulgewicht voor mens en rund insuline.
| | | | | |
Menselijk | 2 | 3,30 | 10,9 | 11,4
Date Added: Apr 20, 2005
Last Update: 17. October 2011 22:35
|