Eiwit Karakterisering die Dynamische & Statische het Lichte Verspreiden zich Technieken Van Instrumenten Malvern Gebruiken

Besproken Onderwerpen

Achtergrond
Het Lichte Verspreiden zich als Hulpmiddel van de Karakterisering
Thermische Denaturatie
De Quaternaire Structuur van Proteïnen
Samenvoeging
De Distributie van de Grootte als functie van Ionische Sterkte
MW en Coëfficiënt Virial
De Ramingen van de Vorm
HPPS
Technische Beschrijvingen

Achtergrond

De stabiliteit van een eiwitformulering aan een verscheidenheid van oplossingsstoringen is kritiek aan zijn succes als farmaceutisch product. Wegens de gevoeligheid van de proteïne aan oplossingsveranderingen, kunnen de invasieve karakteriseringstechnieken problematisch zijn. Het Lichte verspreiden zich is een niet-invasieve techniek die brede goedkeuring op het gebied van proteïne en formuleringskarakterisering heeft ontvangen.

Het Lichte Verspreiden zich als Hulpmiddel van de Karakterisering

De verspreidende intensiteit van een kleine molecule is evenredig aan het vierkant van het moleculegewicht. Als dusdanig, zijn de dynamische en statische het lichte verspreiden zich technieken zeer gevoelig voor het begin van eiwitsamenvoeging die van subtiele veranderingen in de oplossingsvoorwaarden het gevolg zijn. De generatie Van Vandaag van het lichte verspreiden zich instrumentatie omvat hoogst stabiele lasers, vezeloptica, hoge snelheidscorrelators, en enige foton tellende detectors die de meting van eiwitsteekproeven over een waaier van grootte en concentratie vergemakkelijken die nooit voorheen uitvoerbaar is geweest.

Thermische Denaturatie

De structuur van een proteïne wordt gestabiliseerd door een groot aantal waterstofbanden, hydrophobic interactie, en Van der Waal krachten, elk waarvan een kleine graad van stabiliteit tot de algemene structuur bijdraagt. Aangezien de energie aan het systeem via een verhoging van temperatuur wordt toegevoegd, kunnen de stabiliserende krachten worden onderbroken, toestaand de proteïne om te openen of te denatureren. De temperatuur waarbij deze denaturatie voorkomt wordt gedefinieerd als eiwit smeltpunt.

Wanneer een proteïne denatureert, worden de hydrophobic residu's binnen het binnenland van de gevouwen structuur worden begraven blootgesteld aan het oplosmiddel dat. Deze entropically ongunstige staat wordt spoedig vervangen nochtans, met waarin de hydrophobic residu's op één eiwitketting met die op een andere eiwitketting associëren. Wegens de moleculegewichtafhankelijkheid van de verspreidende intensiteit, wordt deze niet-specifieke samenvoeging van gedenatureerde proteïnen gemakkelijk gecontroleerd met het lichte verspreiden zich instrumentatie. Figuur 1 een temperatuuraftasten voor runderhemoglobine, toont en duidelijk op een scherpe verhoging van zowel de grootte als verspreidende intensiteit op het smeltpunt van 45.5°C. wijst.

Figuur 1. Thermisch aftasten voor runderhemoglobine in als buffer opgetreden zout van 0.13 M fosfaat voor, wijzend op een smeltpunt van 45.5 C.

De Quaternaire Structuur van Proteïnen

De quaternaire structuur of de bevolen auto-associatiestaat van een proteïne kan door oplossingseigenschappen zoals pH en de Ionische sterkte worden beïnvloed. De precisie van dynamische het lichte verspreiden zich metingen volstaat om veranderingen in eiwit quaternaire structuur te onderscheiden. Bijvoorbeeld toont Figuur 2 de gemeten groottedistributies voor menselijke en runderinsuline bij pH 2 en pH 7. Bij pH 2, zijn de gemeten diameters voor beide proteïnen (zie Lijst 1) verenigbaar met quaternaire structuren met twee delen, waar het moleculegewicht wordt geschat vanaf empirisch bepaalde grootte versus massaverhoudingen. Bij pH 7, zijn de gemeten diameters verenigbaar met de bekende hexameric vormen van de proteïnen bij fysiologisch pH.

Figuur 2. De distributies van de Grootte voor menselijke en runderinsuline bij pH 7 en pH 2, die op een PH-afhankelijke verandering in quaternaire structuur wijzen.

Lijst 1. Vergelijking van de PH-afhankelijke berekende en bekende moleculegewichtwaarden voor menselijke en runderinsuline.

pH

Dia (NM)

Mext (kDa)

Mknown (kDa)

Vorm

Menselijk

2

3.30

10.9

11.4

Dimeer

7

5.37

33.9

34.2

Hexamer

Runder

2

3.47

12.2

-

Dimeer

7

5.33

33.4

-

Hexamer

Samenvoeging

De additieven van de Formulering, zoals zepen en zouten, kunnen een uitgesproken invloed op de dichtheid van de oppervlaktelast van de proteïne en de oplossings Ionische sterkte hebben. De Subtiele variaties in één van beiden van deze parameters kunnen het verschil tussen een stabiele formulering en een steekproefsamenvoeging betekenen. Wegens zijn gevoeligheid voor hoogte - de moleculegewichtdeeltjes, het dynamische lichte verspreiden zich is een nuttig hulpmiddel om de gevolgen te controleren van formuleringsadditieven bij de eiwitsamenvoeging.

De Distributie van de Grootte als functie van Ionische Sterkte

Figuur 3 toont een bekleding van de groottedistributie voor runderserumalbumine als functie van Ionische sterkte op het isoionic punt van pH 4.8. Voor de concentraties <0.5 M van NaCl, is de groottedistributie monomodal, met een hydrodynamische diameter van ongeveer 8.5 NM. Voor de concentraties <0.5M van NaCl, is de groottedistributie multimodaal, wijzend op de aanwezigheid van eiwitsamenvoeging.

Figuur 3. De distributies van de Grootte voor menselijke en runderinsuline bij pH 7 en pH 2, die op een PH-afhankelijke verandering in quaternaire structuur wijzen.

MW en Coëfficiënt Virial

Voor kleine molecules zoals proteïnen die, kan de steekproef verspreidende intensiteit worden beschreven gebruikend de uitdrukking Rayleigh in Vergelijking 1 wordt getoond, waar K een optische constante is, C is de eiwitconcentratie, is R de verhouding Rayleigh van de analyte intensiteit aan de inherente intensiteit, is M het gewichts gemiddelde analyte moleculegewicht, en A is de 2de virial coëfficiënt.

                        (1)

Zoals voorgesteld in Vergelijking 1, zou een perceel van KC/R versus C, met een onderschepping lineair moeten zijn gelijkwaardig aan 1/M en helling die aan virial coëfficiënt 2 evenredig is. Dit type van de enige analyse van het hoek moleculegewicht is gekend als perceel Debye. Een voorbeeld wordt gegeven in Figuur 4, die de percelen Debye voor lypozyme in het azijnzuurbuffer van 0.1 M en het zoute als buffer opgetreden voor fosfaat van 0.13 M toont. De onderscheppingen in beide percelen zijn verenigbaar met het bekende moleculegewicht van kDa 14.7. Zoals gezien in Figuur 4 nochtans, zijn de 2 virial coëfficiënten sterk afhankelijk van het gebruikte type van buffer.

Figuur 4. De percelen van Debye voor lypozyme in het azijnzuur van 0.10 M treden voor en het zoute als buffer opgetreden voor fosfaat van 0.13 M als buffer op.

De Ramingen van de Vorm

In dynamische het lichte verspreiden zich metingen, wordt de hydrodynamische grootte berekend vanaf de gemeten verspreidingscoëfficiënt via Opstookt vergelijking Einstein, waar een hard gebiedmodel wordt verondersteld. De Afwijkingen in bolvormigheid worden in een verhoging van de hydrodynamische die grootte in vergelijking met de grootte weerspiegeld voor een hard gebied van bekend moleculegewicht wordt berekend. Van theorie Perrin, kan het verschil in deze twee waarden, d.w.z. hydrodynamische grootte en de harde gebiedgrootte, worden gebruikt om de asverhouding voor een ellipsoïde met de zelfde diffusional eigenschappen te schatten.

Figuur 5 een vertegenwoordiging van de kristalstructuur voor lypozyme, tonen en de geometrische asafmetingen omvatten. De rode cirkel is representatief voor de grootte van een hypothetisch hard gebied voor de 14.7 kDaproteïne (specifiek volume = 0.73 mL/g). De groene cirkel is representatief voor de hydrodynamische die grootte, vanaf de gemeten verspreidingscoëfficiënt wordt berekend. Het verschil in de gemeten en theoretische waarden is verenigbaar met een vorm van het ellipsoïdedeeltje met een asverhouding van 1.73, identiek aan de as geometrisch bepaalde verhouding.

Figuur 5. Vertegenwoordiging die van lypozyme, de geometrische asafmetingen, de harde (rode) tonen gebieddiameter, hydrodynamische (groene) diameter, en een ellipsoïde met de zelfde diffusional eigenschappen zoals de (zwarte) proteïne.

HPPS

Het Deeltje Sizer van Hoge Prestaties (HPPS) van Instrumenten Malvern werd specifiek ontworpen om aan de lage concentratievereisten te voldoen typisch verbonden aan eiwittoepassingen, samen met de hoge concentratievereisten voor colloïdale toepassingen. Het Tevredenstellen van deze unieke mengeling van vereisten werd verwezenlijkt via de integratie van een backscatter optisch ontwerp, en ten gevolge van dit ontwerp, overschrijden de specificaties ver die voor een ander dynamisch het lichte verspreiden zich instrument. De HPPS hardware is het zelf optimaliseren, en de software omvat een unieke die „één klikt“ maatregel, analyseert, en rapporteigenschap wordt ontworpen om de het leren kromme te minimaliseren.

Technische Beschrijvingen

Parameter

Specificaties

De waaier van de Grootte (diameter)

0.6nm tot 6µm

De waaier van de Concentratie

0.1 mg/ml Lypozyme aan 20% w/v

Het Volume van de Steekproef

12µL aan 2mL

Laser

Hij-Ne, 3.0mW 633nm

Detector

De fotodiode van de Lawine

De controle van de Temperatuur

10°C aan 55°C (bij omringende temperaturen 20°C)

Uitgebreide temperatureneenheid

10°C aan 90°C (bij omringende temperaturen 20°C)

Bron: „EiwitKarakterisering die Dynamische & Statische Lichte Verspreiding“ Gebruiken, de Nota van de Toepassing door Malvern Instruments.

Voor meer informatie over deze bron te bezoeken gelieve Instrumenten Malvern Instruments Ltd (het UK) of Malvern (de V.S.).

Date Added: Apr 20, 2005 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 01:18

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit