Caracterização da Proteína Usando Técnicas Dinâmicas & Estáticas da Dispersão de Luz dos Instrumentos de Malvern

Assuntos Cobertos

Fundo
Dispersão de Luz como uma Ferramenta da Caracterização
Desnaturação Térmica
A Estrutura Quaternário das Proteínas
Agregação
Distribuição de Tamanho em função da Concentração Iónica
MW e Coeficiente de Virial
Avaliações da Forma
HPPS
Especificações Técnicas

Fundo

A estabilidade de uma formulação da proteína a uma variedade de perturbação da solução é crítica a seu sucesso como um produto farmacêutico. Devido à sensibilidade da proteína às mudanças da solução, as técnicas invasoras da caracterização podem ser problemáticas. A dispersão de Luz é uma técnica não invasora que receba a aceitação larga na área da proteína e da caracterização da formulação.

Dispersão de Luz como uma Ferramenta da Caracterização

A intensidade da dispersão de uma molécula pequena é proporcional ao quadrado do peso molecular. Como tal, as técnicas dinâmicas e estáticas da dispersão de luz são muito sensíveis ao início da agregação da proteína que elevara das mudanças subtis nas condições da solução. A geração De Hoje de instrumentação da dispersão de luz inclui lasers altamente estáveis, fibras ópticas, correlatores de alta velocidade, e o único fotão que conta os detectores que facilitam a medida de amostras da proteína através de uma escala do tamanho e da concentração que nunca antes foi realizável.

Desnaturação Térmica

A estrutura de uma proteína é estabilizada por um grande número ligações de hidrogênio, interacções hidrofóbicas, e forças de Van der Waal, cada qual contribua um grau pequeno de estabilidade à estrutura total. Enquanto a energia é adicionada ao sistema através de um aumento na temperatura, as forças de estabilização podem ser interrompidas, permitindo que a proteína desdobre-se ou desnature-se. A temperatura em que esta desnaturação ocorre é definida enquanto o ponto de derretimento da proteína.

Quando uma proteína desnatura, os resíduos hidrofóbicas enterrados dentro do interior da estrutura dobrada estão expor ao solvente. Este estado entropically desfavorável é logo contudo, com o um onde os resíduos hidrofóbicas em um associado chain da proteína com as aquelas em uma outra corrente da proteína. Devido à dependência do peso molecular da intensidade da dispersão, esta agregação não específica de proteínas desnaturadas é monitorada facilmente com instrumentação da dispersão de luz. Figura 1 mostra uma varredura da temperatura para a hemoglobina bovina, e indica claramente um forte aumento no tamanho e intensidade da dispersão no ponto de derretimento de 45.5°C.

A Figura 1. varredura Térmica para a hemoglobina bovina no fosfato de 0,13 M protegeu salino, indicando um ponto de derretimento de 45,5 C.

A Estrutura Quaternário das Proteínas

A estrutura quaternário ou o estado pedido da auto-associação de uma proteína podem ser influenciados por propriedades da solução tais como o pH e a concentração iónica. A precisão de medidas dinâmicas da dispersão de luz é suficiente para distinguir mudanças na estrutura quaternário da proteína. Por exemplo Figura 2 mostra as distribuições de tamanho medidas para a insulina humana e bovina no pH 2 e no pH 7. No pH 2, os diâmetros medidos para ambas as proteínas (veja a Tabela 1) são consistentes com as estruturas quaternários dimeric, onde o peso molecular é calculado de tamanho empìrica determinado contra relacionamentos em massa. No pH 7, os diâmetros medidos são consistentes com os formulários hexameric conhecidos das proteínas no pH fisiológico.

Figura 2. distribuições de Tamanho para a insulina humana e bovina no pH 7 e no pH 2, indicando uma mudança dependente do pH na estrutura quaternário.

Comparação da Tabela 1. dos valores calculados e conhecidos do dependente do pH do peso molecular para a insulina humana e bovina.

pH

Diâmetro (nanômetro)

Mext (kDa)

Mknown (kDa)

Formulário

Humano

2

3,30

10,9

11,4

Dímero

7

5,37

33,9

34,2

Hexamer

Bovino

2

3,47

12,2

-

Dímero

7

5,33

33,4

-

Hexamer

Agregação

Os aditivos da Formulação, tais como sabões e sais, podem ter uma influência pronunciada na densidade de carga de superfície da proteína e da concentração iónica da solução. As variações Subtis em qualquer um destes parâmetros podem significar a diferença entre uma formulação e uma agregação estáveis da amostra. Devido a sua sensibilidade à elevação - as partículas do peso molecular, dispersão de luz dinâmica são uma ferramenta útil para monitorar os efeitos de aditivos da formulação na agregação da proteína.

Distribuição de Tamanho em função da Concentração Iónica

Figura 3 mostra uma folha de prova da distribuição de tamanho para a albumina de soro bovino em função da concentração iónica no ponto isoionic do pH 4,8. Para as concentrações <0.5 M do NaCl, a distribuição de tamanho é monomodal, com um diâmetro hidrodinâmico de aproximadamente 8,5 nanômetro. Para as concentrações <0.5M do NaCl, a distribuição de tamanho é multi-modal, indicando a presença de agregação da proteína.

Figura 3. distribuições de Tamanho para a insulina humana e bovina no pH 7 e no pH 2, indicando uma mudança dependente do pH na estrutura quaternário.

MW e Coeficiente de Virial

Para moléculas pequenas tais como proteínas, a amostra que dispersa a intensidade pode ser descrita usando a expressão de Rayleigh mostrada na Equação 1, onde K é uma constante óptica, C é a concentração da proteína, R é a relação de Rayleigh da intensidade do analyte à intensidade do incidente, M é o peso molecular médio do analyte do peso, e A é o ò coeficiente virial.

                        (1)

Como sugerido na Equação 1, um lote de KC/R contra C deve ser linear, com uma intercepção equivalente a 1/M e a inclinação que é proporcional ao coeficiente 2 virial. Este tipo de única análise do peso molecular do ângulo é sabido como um lote de Debye. Um exemplo é dado em Figura 4, que mostra os lotes de Debye para o lysozyme no amortecedor do ácido acético de 0,1 M e em um salino protegido fosfato de 0,13 M. As intercepções em ambos os lotes são consistentes com o peso molecular conhecido do kDa 14,7. Como visto em Figura 4 contudo, os 2 coeficientes virial são fortemente dependentes do tipo de amortecedor usado.

Figura 4. lotes de Debye para o lysozyme no amortecedor do ácido acético de 0,10 M e em um salino protegido fosfato de 0,13 M.

Avaliações da Forma

Em medidas dinâmicas da dispersão de luz, o tamanho hidrodinâmico é calculado do coeficiente de difusão medido através do Aviva a equação de Einstein, onde um modelo da esfera dura é supor. Os Desvios no sphericity sãos em um aumento no tamanho hidrodinâmico comparado ao tamanho calculado para uma esfera dura do peso molecular conhecido. Da teoria de Perrin, a diferença nestes dois valores, isto é tamanho hidrodinâmico e o tamanho da esfera dura, pode ser usada para calcular a relação axial para um elipsóide com as mesmas propriedades difusíveis.

Figura 5 mostra uma representação da estrutura de cristal para o lysozyme, e inclui as dimensões axiais geométricas. O círculo vermelho é representante do tamanho de uma esfera dura hipotética para a proteína 14,7 do kDa (volume específico = 0,73 mL/g). O círculo verde é representante do tamanho hidrodinâmico, calculado do coeficiente de difusão medido. A diferença nos valores medidos e teóricos é consistente com uma forma da partícula do elipsóide com uma relação axial de 1,73, idêntica à relação axial determinada geomètrica.

Figura 5. Representação do lysozyme, mostrando as dimensões axiais geométricas, o diâmetro da esfera dura (vermelho), o diâmetro hidrodinâmico (verde), e um elipsóide com as mesmas propriedades difusíveis que a proteína (preto).

HPPS

A Partícula Sizer do Elevado Desempenho (HPPS) dos Instrumentos de Malvern foi projectada especificamente cumprir as baixas exigências da concentração associadas tipicamente com as aplicações da proteína, junto com as exigências da concentração alta para aplicações coloidais. Satisfazer esta mistura original de exigências era realizada através da integração de um projecto óptico do backscatter, e em consequência deste projecto, as especificações excedem distante aquelas para todo o outro instrumento dinâmico da dispersão de luz. O hardware do HPPS é auto que aperfeiçoa, e o software inclui de “uma medida original um clique”, analisa, e relata a característica projetada minimizar a curva de aprendizagem.

Especificações Técnicas

Parâmetro

Especificações

Escala do Tamanho (diâmetro)

0.6nm a 6µm

Escala de Concentração

0,1 mg/mL Lysozyme ao w/v de 20%

Volume de Amostra

12µL a 2mL

Laser

Ele-Ne, 3.0mW 633nm

Detector

Fotodiodo da Avalancha

Controle de Temperatura

10°C a 55°C (no temp 20°C ambiental)

Unidade Prolongada do temp

10°C a 90°C (no temp 20°C ambiental)

Source: Da “Caracterização Proteína Usando o Scatter Claro Dinâmico & Estático”, Nota de Aplicação por Instrumentos de Malvern.

Para obter mais informações sobre desta fonte visite por favor Instrumentos Ltd de Malvern (REINO UNIDO) ou Instrumentos de Malvern (EUA).

Date Added: Apr 20, 2005 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 01:43

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