Характеризация Протеина Используя Динамические & Статические Методы Светлый Разбрасывать От Аппаратур Malvern

Покрытые Темы

Предпосылка
Светлый Разбрасывать как Инструмент Характеризации
Термальный Denaturation
Кватернарная Структура Протеинов
Комплексирование
Распределение по Размеру как функция Ионной Прочности
MW и Коэффициент Virial
Предварительные Подчеты Формы
HPPS
Технические Данные

Предпосылка

Стабилность образования протеина к разнообразие возмущениям разрешения критическая к своему успеху как фармацевтический продукт. Из-за чувствительности протеина к изменениям разрешения, инвазионные методы характеризации могут быть проблемны. Светлый разбрасывать неинвазивный метод который получал широкое принятие в зоне протеина и характеризации образования.

Светлый Разбрасывать как Инструмент Характеризации

Интенсивность разбрасывать малой молекулы пропорциональна к квадрату молекулярного веса. Как таковой, динамические и статические методы светлый разбрасывать очень чувствительны к натиску комплексирования протеина возникая от тонких изменений в условиях разрешения. Сегодняшнее поколение измерительного оборудования светлый разбрасывать включает сильно стабилизированные лазеры, волоконную оптику, высокоскоростные correlators, и одиночный фотон подсчитывая детекторы которые облегчают измерение образцов протеина через ряд размера и концентрации которая никогда раньше достижима.

Термальный Denaturation

Структура протеина стабилизирована большое количество скреплениями водопода, гидродобных взаимодействиями, и усилий Van der Waal, каждый из способствует малую степень стабилности к общей структуре. По Мере Того Как энергия добавлена к системе через увеличение в температуре, стабилизируя усилия можно нарушить, позволяющ протеину раскрыть или денатурировать. Температура на которой этот denaturation происходит определена как точка плавления протеина.

Когда протеин денатурирует, гидродобные выпарки похороненные внутри интерьер сложенной структуры подвергаются действию к растворителю. Это entropically неблагоприятное положение скоро заменено однако, с одним при котором гидродобные выпарки на одной сподвижнице протеина цепной с теми на другой цепи протеина. Из-за зависимости молекулярного веса интенсивности разбрасывать, это неспецифичное комплексирование денатурированных протеинов легко проконтролировано с измерительным оборудованием светлый разбрасывать. На Диаграмму 1 показано развертку температуры для bovine гемоглобина, и ясно показано резкое возрастание и в размере и интенсивность разбрасывать на точку плавления 45.5°C.

Диаграмма 1. Термальная развертка для bovine гемоглобина в фосфате 0,13 M амортизировала saline, показывающ точку плавления C. 45,5.

Кватернарная Структура Протеинов

Кватернарная структура или приказанное положение самоассоциации протеина могут быть повлияны на свойствами разрешения как пэ-аш и ионная прочность. Точность динамических измерений светлый разбрасывать достаточна для того чтобы различить изменения в структуре протеина кватернарной. Например на Диаграмму 2 показано измеренные распределения по размеру для людского и bovine инсулина на пэ-аш 2 и пэ-аш 7. На пэ-аш 2, измеренные диаметры для обоих протеинов (см. Таблица 1) последовательна с димерными кватернарными структурами, где молекулярный вес оценен от эпирически решительно размера против массовых отношений. На пэ-аш 7, измеренные диаметры последовательны с известными hexameric формами протеинов на физиологопсихологическом PH.

Диаграмма 2. Распределения по размеру для людского и bovine инсулина на пэ-аш 7 и пэ-аш 2, показывая изменение пэ-аш зависимое в кватернарной структуре.

Сравнение Таблицы 1. значений иждивенца пэ-аш высчитанных и известных молекулярного веса для людского и bovine инсулина.

пэ-аш

Dia (nm)

Mext (kDa)

Mknown (kDa)

Форма

Людск

2

3,30

10,9

11,4

Димер

7

5,37

33,9

34,2

Hexamer

Bovine

2

3,47

12,2

-

Димер

7

5,33

33,4

-

Hexamer

Комплексирование

Добавки Образования, как мыла и соли, могут иметь произнесенное влияние на плотности поверхностной обязанности протеина и прочности разрешения ионной. Тонкие изменения в том из этих параметров могут значить разницу между стабилизированными образованием и комплексированием образца. Из-за своей чувствительности к высокомолекулярным частицам веса, динамический светлый разбрасывать полезный инструмент для контролировать влияния добавок образования на комплексировании протеина.

Распределение по Размеру как функция Ионной Прочности

На Диаграмму 3 показано верхний слой распределения по размеру для альбумина bovine сыворотки как функция ионной прочности на isoionic этап пэ-аш 4,8. Для концентрации <0.5 M NaCl, распределение по размеру monomodal, с гидродинамическим диаметром около 8,5 nm. Для концентрации <0.5M NaCl, распределение по размеру multi-режимно, показывающ присутсвие комплексирования протеина.

Диаграмма 3. Распределения по размеру для людского и bovine инсулина на пэ-аш 7 и пэ-аш 2, показывая изменение пэ-аш зависимое в кватернарной структуре.

MW и Коэффициент Virial

Для малых молекул как протеины, образец разбрасывая интенсивность можно описать используя выражение Rayleigh показанное в Уровнении 1, где K оптически константа, C концентрация протеина, R коэффициент Rayleigh интенсивности analyte к интенсивности случая, M вес analyte веса средний молекулярный, и A 2-ой virial коэффициент.

                        (1)

Как предложено в Уровнением 1, график KC/R против C должен быть линейным, с перехватом соответствующим к 1/M и наклону который пропорциональн к virial коэффициенту 2. Этот тип одиночного анализа молекулярного веса угла как график Debye. Пример уступан Диаграмма 4, на которую показано графики Debye для лизозима в буфере укусной кислоты 0,1 M и saline 0,13 M амортизированном фосфатом. Перехваты в обоих графиках последовательны с известным молекулярным весом kDa 14,7. Как замечено в Диаграммы 4 однако, 2 virial коэффициента зависел сильно на используемом типе буфера.

Диаграмма 4. графики Debye для лизозима в буфере укусной кислоты 0,10 M и saline 0,13 M амортизированном фосфатом.

Предварительные Подчеты Формы

В динамических измерениях светлый разбрасывать, гидродинамический размер высчитан от измеренного коэффициента диффузии через Гладит Рукой уровнение Эйнштейна, где модель трудной сферы принята. Отступления в шаровидности отражены в увеличении в гидродинамическом размере сравненном к размеру высчитанному для трудной сферы известного молекулярного веса. От теории Perrin, разницу в этих 2 значениях, т.е. гидродинамическом размере и размере трудной сферы, можно использовать для того чтобы оценить коэффициент осей для эллипсойда с такими же diffusional свойствами.

На Диаграмму 5 показано представление кристаллической структуры для лизозима, и включает геометрические осевые размеры. Красный круг представитель размера постулативной трудной сферы для протеина 14,7 kDa (специфического тома = 0,73 mL/g). Зеленый круг представитель гидродинамического размера, высчитанный от измеренного коэффициента диффузии. Разница в измеренных и теоретических значениях последовательна с формой частицы эллипсойда с коэффициентом осей 1,73, идентичным к коэффициенту осей определенному геометрически.

Диаграмма 5. Представление лизозима, показывая геометрические осевые размеры, диаметр трудной сферы (красный), гидродинамический диаметр (зеленый цвет), и эллипсойд с такими же diffusional свойствами как протеин (чернота).

HPPS

Частица Sizer Высокой Эффективности (HPPS) от Аппаратур Malvern специфически была конструирована для того чтобы соотвествовать низкие концентрации типично связанные с применениями протеина, вместе с требованиями к высокой концентрации для коллоидных применений. Удовлетворять это уникально смешивание требований был совершен через внедрение конструкции backscatter оптически, и как последствие этой конструкции, спецификации далеко опередили те для любой другой динамической аппаратуры светлый разбрасывать. Оборудование HPPS собственная личность оптимизируя, и ПО включает уникально «измерение одного щелчка», анализирует, и сообщает характеристику конструированную для того чтобы уменьшить кривую освоения.

Технические Данные

Параметр

Спецификации

Ряд Размера (диаметр)

0.6nm до 6µm

Ряд Концентрации

0,1 mg/mL Лизозим к w/v 20%

Том Образца

12µL к 2mL

Лазер

Он-Ne, 3.0mW 633nm

Детектор

Фотодиод Лавины

Контроль температуры

10°C к 55°C (на окружающем temp 20°C)

Выдвинутый блок temp

10°C к 90°C (на окружающем temp 20°C)

Источник: «Характеризация Протеина Используя Динамический & Статический Светлый Scatter», Примечание по Применению Аппаратурами Malvern.

Для больше информации на этом источнике пожалуйста посетите Аппаратуры Ltd Malvern (ВЕЛИКОБРИТАНИЮ) или Аппаратуры Malvern (США).

Date Added: Apr 20, 2005 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 01:45

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit