Att Använda för ProteinKarakterisering som Är Dynamiskt, & SpridningTekniker för Statisk elektricitet Från Malvern Instrumenterar Lätt

Täckte Ämnen

Bakgrund
Den Ljusa Spridningen som en Karakterisering Bearbetar
Termisk Denaturation
De Quaternary Strukturerar av Proteiner
Aggregation
Storleksanpassa Fördelning som en Fungera av Ionic Styrka
Samverkas MW och Virial
ShapeBedömningar
HPPS
Tekniska Specifikationer

Bakgrund

Stabiliteten av en proteinutformning till en variation av lösningsperturbations är kritisk till dess framgång som en farmaceutisk produkt. På grund av känsligheten av proteinet till lösningsändringar kan invasive karakteriseringtekniker vara problematiska. Den Ljusa spridningen är eninvasive teknik som har mottagit brett godtagande i området av protein och utformningkarakteriseringen.

Den Ljusa Spridningen som en Karakterisering Bearbetar

Spridningstyrkan av en liten molekyl är proportionell till kvadrera av det molekylärt väger. Som sådan, dynamiskt och statisk elektricitet som ljusa spridningtekniker är mycket känsliga till starten av proteinaggregation som uppstår från subtila ändringar i lösningen, villkorar. Den Dagens utvecklingen av ljus spridninginstrumentation inkluderar högt stabila laser, fiberoptik, snabba correlators, och singelfotonen som räknar avkännare, som gör mätningen av protein lättare, tar prov över en spänna av storleksanpassar och koncentration som har aldrig för varit uppnåelig.

Termisk Denaturation

Strukturera av ett protein stabiliseras av ett stort nummer av väteförbindelser, hydrophobic växelverkan, och Skåpbil der Waal styrkor, varje av som bidrar en liten grad av stabilitet till overallen, strukturerar. Som energi tillfogas till systemet via en förhöjning i temperatur, kan de stabiliserande styrkorna avbrytas och att låta proteinet veckla upp eller denature. Temperaturen, som denna denaturation uppstår på, definieras, som proteinsmältningen pekar.

När ett protein denatures, strukturerar de hydrophobic restna som begravas inom inre av vikt, är utsatta till vätskan. Detta entropically ogynnsamma statligt byts ut snart emellertid, med en där de hydrophobic restna på ett protein kedjar bundsförvanten med de på ett annat protein kedjar. På grund av det molekylärt väga beroende av spridningstyrkan, denna non-närmare detalj aggregation av denatured proteiner övervakas lätt med ljus spridninginstrumentation. Figurera shows 1 en temperaturbildläsning för nötkreaturs- haemoglobin och indikerar klart att en korförhöjning i båda storleksanpassa- och spridningstyrkan på smältningen pekar av 45.5°C.

Figurera 1. Den Termiska bildläsningen för nötkreaturs- haemoglobin i 0,13 M phosphate fungera som buffert saltdamm som indikerar en smältning, pekar av 45,5 C.

De Quaternary Strukturerar av Proteiner

De quaternary strukturerar eller beställde själv-anslutningen som är statlig av ett protein, kan påverkas av lösningsrekvisita liksom pHen och den ionic styrkan. Precisionen av dynamiska ljusa spridningmätningar är tillräcklig att skilja ändringar i quaternary protein strukturerar. Figurera Till exempel 2 shows som mätte storleksanpassar fördelningor för människa och nötkreaturs- insulin på pH 2 och pH 7. På pH 2, är de mätte diametrarna för båda proteiner (se för att Bordlägga 1), jämna med dimeric quaternary strukturerar, var det molekylärt väger beräknas från empirically beslutsamt storleksanpassar vs. samlas förhållanden. På pH 7, är de mätte diametrarna jämna med det bekant hexameric bildar av proteinerna på fysiologisk pH.

Figurera 2. Storleksanpassa fördelningor för människa, och nötkreaturs- insulin på pH 7 och pH 2 som indikerar en pH-anhörigändring i quaternary, strukturerar.

Bordlägga 1. Jämförelsen av beräknat och bekant molekylärt för pH-anhörigen väger värderar för människa och nötkreaturs- insulin.

pH

Diameter (nm)

Mext (kDa)

Mknown (kDa)

Bilda

Människa

2

3,30

10,9

11,4

Dimer

7

5,37

33,9

34,2

Hexamer

Nötkreaturs-

2

3,47

12,2

-

Dimer

7

5,33

33,4

-

Hexamer

Aggregation

Utformningtillsatser, liksom tvålar och saltar, kan ha en uttalad påverkan på ytbehandlaladdningstätheten av proteinet och den ionic styrkan för lösning. Subtila variationer i endera av dessa parametrar kan betyda skillnaden mellan en stabil utformning och ta prov aggregation. På grund av dess känslighet till den molekylära kicken - väga partiklar, den dynamiska ljusa spridningen är ett användbart bearbetar för att övervaka verkställer av utformningtillsatser på proteinaggregation.

Storleksanpassa Fördelning som en Fungera av Ionic Styrka

Figurera 3 shows som en överdra av storleksanpassafördelningen för nötkreaturs- serumäggviteämnen som en fungera av ionic styrka på det isoionic pekar av pH 4,8. För NaCl-koncentrationer <0.5 M, är storleksanpassafördelningen monomodal, med en hydrodynamic diameter av omkring 8,5 nm. För NaCl-koncentrationer <0.5M, är storleksanpassafördelningen mång--modal och att indikera närvaroen av proteinaggregation.

Figurera 3. Storleksanpassa fördelningor för människa, och nötkreaturs- insulin på pH 7 och pH 2 som indikerar en pH-anhörigändring i quaternary, strukturerar.

Samverkas MW och Virial

För lilla molekylar liksom proteiner kan ta provspridningstyrkan beskrivas genom att använda det Rayleigh uttryckt som visas i Likställande 1, var K är en optisk konstant, C är proteinkoncentrationen, är R det Rayleigh förhållandet av analytestyrkan till den infalla styrkan, är M den molekylära vägagenomsnittanalyten väger, och A är det 2nd virial samverka.

                        (1)

Som möjligt i Likställande 1, bör en täppa av KC/R vs. C vara linjär, med en fånga uppmotsvarighet till 1/M och slutta som är proportionell till det 2 virial samverka. Denna typ av singeln metar molekylärt väger analys är bekant som en Debye täppa. Ett exempel ges in Figurerar 4, som visar att de Debye täpporna för lysozyme i 0,1 M ättiksyra fungera som buffert och 0,13 M den phosphate fungera som buffert saltdammet. Fångar upp i båda täppor är jämnt med det bekant molekylärt väger av kDaen 14,7. Som sett in Figurera 4 emellertid, de 2 virial koefficienterna är anhörigen på typen av fungera som buffert starkt använt.

Figurera 4. Debye täppor för lysozyme i 0,10 M ättiksyra fungera som buffert och 0,13 M den phosphate fungera som buffert saltdammet.

ShapeBedömningar

I dynamiska ljusa spridningmätningar storleksanpassar de hydrodynamic beräknas från den mätte diffusionen som är samverka via, Fyller på med bränsle den Einstein likställanden, var en hård sphere modellerar antas. Avsteg i sphericity reflekteras i en förhöjning i det hydrodynamic storleksanpassar jämfört till storleksanpassa som beräknas för en hård sphere av bekant molekylärt, väger. Från den Perrin teorin värderar skillnaden i dessa två, dvs. hydrodynamic storleksanpassa, och den hårda spheren storleksanpassar, kan vara den van vid bedömningen det axiella förhållandet för en ellipsoid med den samma diffusional rekvisitan.

Figurera 5 shows som en framställning av kristallen strukturerar för lysozyme och inkluderar det geometriska axiellt dimensionerar. Det rött cirklar är representativt av storleksanpassa av en hypotetisk hård sphere för kDaproteinet 14,7 (specifik volym = 0,73 mL/g). Gräsplanen cirklar är representativ av det hydrodynamic storleksanpassar, beräknat från den samverka mätte diffusionen. Skillnaden i mätt och det teoretiskt värderar är jämna med en ellipsoidpartikel formar med ett axiellt förhållande av 1,73 som är identiskt till det beslutsamma axiella förhållandet geometriskt.

Figurera 5. Framställning av lysozyme, visningen som det geometriska axiellt dimensionerar, hårda (den röda) spherediametern, den hydrodynamic diametern (gräsplan) och en ellipsoid med den samma diffusional rekvisitan som proteinet (svart).

HPPS

KickKapacitetsPartikeln Sizer (HPPS) från Malvern Instruments planlades specifikt för att möta de låga koncentrationskraven som typisk var tillhörande med proteinapplikationer, tillsammans med kickkoncentrationskraven för colloidal applikationer. Att Tillfredsställa denna unika blandning av krav var fulländat via integrationen av en optisk design för backscatter, och som en följd av denna design, överskrider specifikationerna långt de för någon annan dynamisk ljus spridning instrumenterar. HPPS-maskinvaran är själven som optimerar, och programvaran inkluderar unik ”klickar” mäter, analyserar, och rapportsärdrag som planläggs för att minimera lära, buktar.

Tekniska Specifikationer

Parameter

Specifikationer

Size spänner (diametern)

0.6nm till 6µm

Koncentration spänner

0,1 mg/mL Lysozyme till 20% w/v

Ta Prov Volym

12µL till 2mL

Laser

Han-Ne 3.0mW 633nm

Avkännare

Lavinfotodiod

Temperaturen kontrollerar

10°C till 55°C (på omgivande vikarier 20°C)

Fördjupad vikarieenhet

10°C till 90°C (på omgivande vikarier 20°C)

Källa: ”Noterar Att Använda för ProteinKarakterisering som Är Dynamiskt, & Scatteren för Statisk elektricitet Lätt”, Applikationen vid Malvern Instrumenterar.

För mer information på denna källa behaga besök Malvern Instrumenterar AB (UK), eller Malvern Instrumenterar (USA).

Date Added: Apr 20, 2005 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 01:51

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit