Ämnen som tas upp
Bakgrund
Ljusspridning som en karakterisering verktyg
Termisk Denaturering
Den Quaternary proteiners struktur
Aggregation
Storleksfördelning som en funktion av jonstyrka
MW och Virial Koefficient
Shape Uppskattningar
HPPS
Tekniska specifikationer
Bakgrund
Stabiliteten hos ett protein formulering till olika lösning störningar är avgörande för dess framgång som ett läkemedel. På grund av känsligheten på protein för att lösningen ändringarna kan invasiva karakteriseringstekniker vara problematiskt. Ljusspridning är en icke-invasiv teknik som har fått bred acceptans inom området protein och formulering karakterisering.
Ljusspridning som en karakterisering verktyg
Den spridning intensitet en liten molekyl är proportionell mot kvadraten på molekylvikt. Som sådan dynamisk och statisk ljusspridning tekniker är mycket känsliga för uppkomsten av proteinaggregering följd av subtila förändringar i lösningen förhållanden. Dagens generation av ljusspridning instrumentering innehåller mycket stabil laser, fiberoptik, hög correlators hastighet, och enda foton räkna detektorer som underlättar mätning av protein prover inom en rad olika storlek och koncentration som aldrig tidigare varit möjligt.
Termisk Denaturering
Strukturen av ett protein som stabiliseras av ett stort antal vätebindningar, hydrofoba interaktioner, och Van der Waals krafter, som alla bidrar med en liten grad av stabilitet till den övergripande strukturen. Som energi läggs till systemet via en temperaturökning, kan den stabiliserande krafter rubbas, vilket gör att proteinet att utvecklas eller denaturera. Den temperatur vid vilken denna denaturering sker definieras som proteinet smältpunkt.
När ett protein denaturerar, är de hydrofoba resterna begravdes i det inre av vikta strukturen utsätts för lösningsmedel. Detta entropically ogynnsamma tillstånd är snart ersätts dock med en vari hydrofoba rester på ett protein kedja förknippar med dem på ett annat protein kedjan. På grund av den molekylvikt beroendet till spridningen intensitet, detta är icke-specifika aggregering av denaturerade proteiner lätt övervakas med ljusspridning instrumentering. Figur 1 visar en temperatur söka efter bovin hemoglobin, och tydligt visar på en kraftig ökning i både storlek och spridningen intensitet vid smältpunkt på 45,5 ° C.
Figur 1. Termisk söka efter bovin hemoglobin i 0,13 M fosfatbuffrad saltlösning, vilket indikerar en smältpunkt på 45,5 C.
Den Quaternary proteiners struktur
Den kvartära struktur eller beställas egen förening tillstånd av ett protein kan påverkas av lösningen egenskaper, såsom pH och jonstyrka. Precisionen i dynamiska mätningar ljusspridning är tillräcklig för att särskilja förändringar i proteinet kvartära struktur. Till exempel Figur 2 visar den uppmätta storleken fördelningar för mänskliga och bovint insulin vid pH 2 och pH 7. Vid pH 2, De uppmätta diametrarna för både proteiner (se tabell 1) är förenliga med dimeriskt kvartär strukturer, där molekylvikt är uppskattat från empiriskt bestämd storlek kontra relationer massa. Vid pH 7, den uppmätta diametern överensstämmer med den kända hexameric former av proteinerna vid fysiologiskt pH.
Figur 2. Storlek fördelningar för mänskliga och bovint insulin vid pH 7 och pH 2, vilket indikerar ett pH-beroende förändringar i kvartära struktur.
Tabell 1. Jämförelse av pH-beroende beräknas och känd molekylvikt värden för människor och bovint insulin.