使用动态 & 静态光散射技术的蛋白质描述特性从 Malvern 仪器

包括的事宜

背景
光散射作为描述特性工具
热量变性
蛋白质四级结构
汇总
作为离子强度功能的大小分布
兆瓦和 Virial 系数
形状估计
HPPS
技术规格

背景

蛋白质公式化的稳定性对各种各样的解决方法扰动的对其成功至关重要作为一种药品。 由于蛋白质的区分对解决方法更改的,入侵的描述特性技术可以是有问题的。 光散射是在蛋白质和公式化描述特性区接受了宽接受的一个非侵入性的技术。

光散射作为描述特性工具

一个小的分子的分散强度与分子量的正方形是按比例。 同样地,动态和静态光散射技术对出现从在解决方法条件上的细微的变化的蛋白质汇总起始是非常敏感的。 光散射手段的今天生成包括很稳定的激光、纤维光学、高速相关器和计数实现蛋白质范例评定在范围和浓度间的范围的以前从未是可达成的探测器的唯一光子。

热量变性

蛋白质的结构由很大数量的氢键、疏水交往和范 der Waal 强制稳定,其中每一造成一个小的程度稳定性整体结构。 当能源被添加到这个系统通过在温度的一个增量,可以打乱稳定的强制,允许蛋白质展开或弈质。 此变性发生的温度被定义作为蛋白质熔点。

当蛋白质弈质时,在这个被折叠的结构的内部内被埋没的疏水残滓显示在这种溶剂。 然而此 entropically 不赞同的状态用一个很快替换,在一蛋白质链关联的疏水残滓有那些的在另一个蛋白质链子。 由于分散强度的分子量依赖性,被弈质的蛋白质的此未指明的汇总容易地监控与光散射手段。 图 1 显示迟钝的血红蛋白的温度扫描和明显地指示在这个范围的猛增和分散强度在 45.5°C. 熔点。

图 1. 迟钝的血红蛋白的热量扫描在 0.13 M 磷酸缓冲盐,指示熔点 45.5 C。

蛋白质四级结构

蛋白质的四级结构或被定购的自缔合状态可以被解决方法属性影响例如酸碱度和离子强度。 动态光散射评定精确度是满足区分在蛋白质四级结构上的变化。 例如图 2 显示人力和迟钝的胰岛素的被评定的大小分布在酸碱度 2 和酸碱度 7。 在酸碱度 2,两蛋白质的被评定的直径 (参见表 1) 与由两部分组成的四级结构是一致的,分子量从经验为主地确定的范围估计与质量关系。 在酸碱度 7,被评定的直径与蛋白质的已知的 hexameric 表单是一致的在生理 PH。

图 2. 人力和迟钝的胰岛素的大小分布在酸碱度 7 和酸碱度 2,指示在四级结构上的酸碱度从属的变化。

酸碱度受抚养者被计算的和已知的分子量值的表 1. 比较人力和迟钝的胰岛素的。

酸碱度

Dia (nm)

Mext (kDa)

Mknown (kDa)

表单

人力

2

3.30

10.9

11.4

二聚体

7

5.37

33.9

34.2

Hexamer

迟钝

2

3.47

12.2

-

二聚体

7

5.33

33.4

-

Hexamer

汇总

公式化附加,例如肥皂和盐,可能有对蛋白质和解决方法离子强度的表面电荷密度的显著的影响。 在这些参数之一的上细微的变化可能意味在稳定的公式化和范例汇总之间的区别。 由于其对高分子重微粒的区分,动态光散射是为监控公式化附加的作用的有用的工具对蛋白质汇总。

作为离子强度功能的大小分布

图 3 显示大小分布的重叠迟钝的乳清蛋白的作为离子强度功能在 isoionic 问题的酸碱度 4.8。 对于 NaCl 含量 <0.5 M,大小分布是 monomodal,与一条水力直径大约 8.5 毫微米。 对于 NaCl 含量 <0.5M,大小分布多重模态分布,指示蛋白质汇总出现。

图 3. 人力和迟钝的胰岛素的大小分布在酸碱度 7 和酸碱度 2,指示在四级结构上的酸碱度从属的变化。

兆瓦和 Virial 系数

对小的分子例如蛋白质,分散强度的这个范例可以被描述使用在式显示的 Rayleigh 表达式 1,其中 K 是一个光学常数, C 是蛋白质含量, R 是分析物强度的 Rayleigh 比与事件强度, M 是平均重量分析物分子量,并且 A 是第 2 个 virial 系数。

                        (1)

如在式 1 上建议, KC/R 剧情与 C 应该是线性的,与截住相当于与这个 2 virial 系数是按比例的 1/M 和倾斜。 此种唯一角度分子量分析是公认的 Debye 剧情。 例子在表 4 举,在 0.1 M 乙酸缓冲和 0.13 M 磷酸缓冲盐显示溶菌酶的 Debye 剧情。 在两种剧情的截住与 14.7 kDa 已知的分子量是一致的。 然而如在图 4 中看到, 2 个 virial 系数取决严格于使用的缓冲的种类。

图 4. 溶菌酶的 Debye 剧情在 0.10 M 乙酸缓冲和 0.13 M 磷酸缓冲盐。

形状估计

在动态光散射评定,这个水力范围从被评定的扩散率被计算通过升火爱因斯坦等式,一个硬小球设计假设。 在球状的偏差在这个水力范围的一个增量被反射与为已知的分子量一个硬小球计算的这个范围比较。 从 Perrin 原理,区别按这两个值,即水力范围和硬小球范围,可以用于估计一个椭球的轴比与同样 diffusional 属性。

图 5 显示晶体结构的表示溶菌酶的,并且包括几何轴向维数。 红色圈子是一个假定硬小球的范围的代表 14.7 kDa 蛋白质的 (体积度 = 0.73 mL/g)。 绿色圈子是这个水力范围的代表,计算从被评定的扩散率。 区别按被评定的和理论上的值与椭球微粒形状是一致的以轴比 1.73,相同与几何上被确定的轴比。

图 5. 溶菌酶表示,显示几何轴向维数、硬小球直径 (红色),水力直径 (绿色) 和与 diffusional 属性的一个椭球和蛋白质 (黑色) 一样。

HPPS

Malvern 仪器的 (HPPS)高性能微粒 Sizer 特别地被设计符合低浓度要求典型地与蛋白质应用相关,以及胶质应用的高浓度需求。 满足需求的此唯一混合通过一个背景散射的光学设计的综合化是实现的,作为此设计结果,并且,说明超出那些其他动态光散射仪器的。 HPPS 硬件是优选的自,并且这个软件包括一个唯一 “一单击”评定,分析,并且报告被设计的功能使这条经验曲线减到最小。

技术规格

参数

说明

范围范围 (直径)

0.6nm 到 6µm

浓度范围

对 20% w/v 的 0.1 mg/mL 溶菌酶

范例数量

对 2mL 的 12µL

激光

他 Ne, 3.0mW 633nm

探测器

雪崩光电二极管

温度控制

对 55°C 的 10°C (在 20°C 四周临时)

延长的临时部件

对 90°C 的 10°C (在 20°C 四周临时)

来源: “使用动态 & 静态轻的消散的蛋白质描述特性”,由 Malvern 仪器的应用注解。

关于此来源的更多信息请参观 Malvern 有限公司 (英国) 仪器Malvern 仪器 (美国)

Date Added: Apr 20, 2005 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 01:13

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