使用動態 & 靜態光散射技術的蛋白質描述特性從 Malvern 儀器

包括的事宜

背景
光散射作為描述特性工具
熱量變性
蛋白質四級結構
彙總
作為離子強度功能的大小分佈
兆瓦和 Virial 系數
形狀估計
HPPS
技術規格

背景

蛋白質公式化的穩定性對各種各樣的解決方法擾動的對其成功至關重要作為一種藥品。 由於蛋白質的區分對解決方法更改的,入侵的描述特性技術可以是有問題的。 光散射是在蛋白質和公式化描述特性區接受了寬接受的一個非侵入性的技術。

光散射作為描述特性工具

一個小的分子的分散強度與分子量的正方形是按比例。 同樣地,動態和靜態光散射技術對出現從在解決方法條件上的細微的變化的蛋白質彙總起始是非常敏感的。 光散射手段的今天生成包括很穩定的激光、纖維光學、高速相關器和計數實現蛋白質範例評定在範圍和濃度間的範圍的以前從未是可達成的探測器的唯一光子。

熱量變性

蛋白質的結構由很大數量的氫鍵、疏水交往和範 der Waal 強制穩定,其中每一造成一個小的程度穩定性整體結構。 當能源被添加到這個系統通過在溫度的一個增量,可以打亂穩定的強制,允許蛋白質展開或弈質。 此變性發生的溫度被定義作為蛋白質熔點。

當蛋白質弈質時,在這個被摺疊的結構的內部內被埋沒的疏水殘滓顯示在這種溶劑。 然而此 entropically 不讚同的狀態用一个很快替換,在一蛋白質鏈關聯的疏水殘滓有那些的在另一個蛋白質鏈子。 由於分散強度的分子量依賴性,被弈質的蛋白質的此未指明的彙總容易地監控與光散射手段。 圖 1 顯示遲鈍的血紅蛋白的溫度掃描和明顯地指示在這個範圍的猛增和分散強度在 45.5°C. 熔點。

圖 1. 遲鈍的血紅蛋白的熱量掃描在 0.13 M 磷酸緩衝鹽,指示熔點 45.5 C。

蛋白質四級結構

蛋白質的四級結構或被定購的自締合狀態可以被解決方法屬性影響例如酸碱度和離子強度。 動態光散射評定精確度是滿足區分在蛋白質四級結構上的變化。 例如圖 2 顯示人力和遲鈍的胰島素的被評定的大小分佈在酸碱度 2 和酸碱度 7。 在酸碱度 2,兩蛋白質的被評定的直徑 (參見表 1) 與由兩部分組成的四級結構是一致的,分子量從經驗為主地確定的範圍估計與質量關係。 在酸碱度 7,被評定的直徑與蛋白質的已知的 hexameric 表單是一致的在生理 PH。

圖 2. 人力和遲鈍的胰島素的大小分佈在酸碱度 7 和酸碱度 2,指示在四級結構上的酸碱度從屬的變化。

酸碱度受撫養者被計算的和已知的分子量值的表 1. 比較人力和遲鈍的胰島素的。

酸碱度

Dia (nm)

Mext (kDa)

Mknown (kDa)

表單

人力

2

3.30

10.9

11.4

二聚體

7

5.37

33.9

34.2

Hexamer

遲鈍

2

3.47

12.2

-

二聚體

7

5.33

33.4

-

Hexamer

彙總

公式化附加,例如肥皂和鹽,可能有對蛋白質和解決方法離子強度的表面電荷密度的顯著的影響。 在這些參數之一的上細微的變化可能意味在穩定的公式化和範例彙總之間的區別。 由於其對高分子重微粒的區分,動態光散射是為監控公式化附加的作用的有用的工具對蛋白質彙總。

作為離子強度功能的大小分佈

圖 3 顯示大小分佈的重疊遲鈍的乳清蛋白的作為離子強度功能在 isoionic 問題的酸碱度 4.8。 對於 NaCl 含量 <0.5 M,大小分佈是 monomodal,與一條水力直徑大約 8.5 毫微米。 對於 NaCl 含量 <0.5M,大小分佈多重模態分佈,指示蛋白質彙總出現。

圖 3. 人力和遲鈍的胰島素的大小分佈在酸碱度 7 和酸碱度 2,指示在四級結構上的酸碱度從屬的變化。

兆瓦和 Virial 系數

对小的分子例如蛋白質,分散強度的這個範例可以被描述使用在式顯示的 Rayleigh 表達式 1,其中 K 是一個光學常數, C 是蛋白質含量, R 是分析物強度的 Rayleigh 比與事件強度, M 是平均重量分析物分子量,并且 A 是第 2 個 virial 系數。

                        (1)

如在式 1 上建議, KC/R 劇情與 C 應該是線性的,與截住相當於與這個 2 virial 系數是按比例的 1/M 和傾斜。 此種唯一角度分子量分析是公認的 Debye 劇情。 例子在表 4 舉,在 0.1 M 乙酸緩衝和 0.13 M 磷酸緩衝鹽顯示溶菌酶的 Debye 劇情。 在兩種劇情的截住與 14.7 kDa 已知的分子量是一致的。 然而如在圖 4 中看到, 2 個 virial 系數取決嚴格於使用的緩衝的種類。

圖 4. 溶菌酶的 Debye 劇情在 0.10 M 乙酸緩衝和 0.13 M 磷酸緩衝鹽。

形狀估計

在動態光散射評定,這個水力範圍從被評定的擴散率被計算通過昇火愛因斯坦等式,一個硬小球設計假設。 在球狀的偏差在這個水力範圍的一個增量被反射與為已知的分子量一個硬小球計算的這個範圍比較。 從 Perrin 原理,區別按這兩個值,即水力範圍和硬小球範圍,可以用於估計一個橢球的軸比與同樣 diffusional 屬性。

圖 5 顯示晶體結構的表示溶菌酶的,并且包括幾何軸向維數。 紅色圈子是一個假定硬小球的範圍的代表 14.7 kDa 蛋白質的 (體積度 = 0.73 mL/g)。 綠色圈子是這個水力範圍的代表,計算從被評定的擴散率。 區別按被評定的和理論上的值與橢球微粒形狀是一致的以軸比 1.73,相同與幾何上被確定的軸比。

圖 5. 溶菌酶表示,顯示幾何軸向維數、硬小球直徑 (紅色),水力直徑 (綠色) 和與 diffusional 屬性的一個橢球和蛋白質 (黑色) 一樣。

HPPS

Malvern 儀器的 (HPPS)高性能微粒 Sizer 特別地被設計符合低濃度要求典型地與蛋白質應用相關,以及膠質應用的高濃度需求。 滿足需求的此唯一混合通過一個背景散射的光學設計的綜合化是實現的,作為此設計結果,并且,說明超出那些其他動態光散射儀器的。 HPPS 硬件是優選的自,并且這個軟件包括一個唯一 「一單擊」評定,分析,并且報告被設計的功能使這條經驗曲線減到最小。

技術規格

參數

說明

範圍範圍 (直徑)

0.6nm 到 6µm

濃度範圍

對 20% w/v 的 0.1 mg/mL 溶菌酶

範例數量

對 2mL 的 12µL

激光

他 Ne, 3.0mW 633nm

探測器

雪崩光電二極管

溫度控制

對 55°C 的 10°C (在 20°C 四周臨時)

延長的臨時部件

對 90°C 的 10°C (在 20°C 四周臨時)

來源: 「使用動態 & 靜態輕的消散的蛋白質描述特性」,由 Malvern 儀器的應用註解。

關於此來源的更多信息请請參觀 Malvern 有限公司 (英國) 儀器Malvern 儀器 (美國)

Date Added: Apr 20, 2005 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 01:16

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit