Temas Abordados
Fundo
Determinação de tamanho de partícula por espalhamento de luz estático
Requisitos das medições de peso molecular
Resultados
Polímeros
Polissacarídeos
Conclusões
Fundo
O Sistema Zetasizer Nano combina dinâmica, as tecnologias de luz estático e espalhamento eletroforético propício para a medição do tamanho das partículas, peso molecular e potencial zeta.
Determinação de tamanho de partícula por espalhamento de luz estático
Espalhamento de luz estático (SLS) é uma técnica não-invasiva utilizada para a caracterização de macromoléculas em solução. Um feixe de luz monocromática é direcionado através de uma amostra ea intensidade da luz espalhada em um ângulo de 173 ° pelas moléculas é medido. SLS faz uso da intensidade média de tempo da luz espalhada, de que o peso molecular de peso médio e coeficiente virial segundo pode ser determinada.
A intensidade da luz dispersa que uma macromolécula produz é proporcional ao produto do peso peso médio molecular e da concentração da macromolécula. Para moléculas que não mostram a dependência angular em sua dispersão, a relação entre a intensidade da luz espalhada e seu peso molecular é dada pela equação de Rayleigh:
onde K é uma constante óptico, R θ é a razão do Rayleigh espalhada a intensidade de luz incidente, M é o peso molecular de peso médio, A 2 é o segundo coeficiente virial e C é a concentração da amostra.
Assim, um lote de KC / Rθ versus C deverá ser linear com um equivalente interceptar a 1 / M e um declive igual ao coeficiente segundo virial A 2. Tal conspiração é conhecido como um complô Debye.
O segundo coeficiente virial é uma propriedade que descreve a força da interação entre a molécula eo solvente. Para amostras onde A> 2 0, as moléculas tendem a permanecer em solução. Quando A = 2 0, a molécula-solvente força da interação é equivalente à força da interação molécula-molécula eo solvente é descrito como sendo um solvente teta. Quando A <2 0, as moléculas tenderão a se cristalizar ou agregado.
Mais detalhes sobre a teoria das determinações de peso molecular a partir de medidas de espalhamento de luz estático pode ser encontrada nas notas de outras aplicações disponíveis no Malvern Instruments website.
Esta nota de aplicação detalhes medidas de peso molecular realizados em várias proteínas, polímeros e polissacarídeos sobre o Nano Zetasizer .
Requisitos das medições de peso molecular
- Zetasizer Nano S ou ZS (instrumentos que incorporam ENE ™ óptica)
- Quartzo cuvete
- Preparação de uma série de concentrações da molécula desconhecida (proteína ou polímero) em um solvente adequado
- Determinação do índice de incremento diferencial de refração (dn / dc). Este trabalho pode ser encontrado a partir de fontes bibliográficas ou medida através de um refratômetro adequado. O valor de dn / dc para proteínas globulares, por exemplo, é 0.185ml / g
- Medição da intensidade de espalhamento de uma amostra padrão cuja Rayleigh Razão é conhecido. Este é recomendado para ser tolueno como o valor é conhecido em vários comprimentos de onda. Por exemplo, a relação de Rayleigh de tolueno em 633 nm é 1,3522 x 10 -5 cm -1
- Medição da intensidade de espalhamento da amostra de concentração zero (se o solvente é diferente para tolueno)
- Medição da intensidade de espalhamento de diferentes concentrações de amostra
Note-se que o Nano Zetasizer software mede a intensidade da luz espalhada das amostras preparadas e calcula automaticamente o peso molecular e coeficiente virial segundo a partir dos dados utilizando um diagrama de Debye.
Resultados
Polímeros
A Figura 1 mostra as parcelas de um único ângulo de Debye para uma série de padrões de poliestireno polímero preparada em tolueno e medidos em um Nano Zetasizer S. Os pesos medidos molecular e segundo coeficientes de virial (A 2), juntamente com conhecidos valores de peso molecular, são dadas em tabela 1. Em cada caso, o valor de dn / dc foi levado para ser 0.110ml / g.
Parcelas figura 1. Debye para polímeros de poliestireno.
Tabela 1. Pesos Molecular e segundo coeficientes de virial (A2) de polímeros de poliestireno preparada em tolueno
| | | |
Amostra A | 1,08 | 0,980 | -2.37x10 -2 |
Amostra B | 9,865 | 9,86 | 17.51x10 -4 |
Amostra C | 102 | 96 | 8.25x10 -4 |
Como mostrado na tabela de resultados, os pesos calculados molecular são consistentes com os valores conhecidos.
Os gradientes de cada parcela (os coeficientes segundo virial) variam de positivo (poliestireno 9.9KDa) para negativa (padrão de poliestireno 980Da). O segundo coeficiente virial positiva, indicando que a energia de interação entre cada polímero eo solvente é mais forte do que a energia de interação entre o polímero e ele próprio. Considerando que o segundo coeficiente virial negativo indica que as moléculas de polímero não gosta de tolueno como solvente.
Polissacarídeos
O enredo Debye obtido a partir de uma amostra de dextrana em água é mostrada na figura 2. A amostra teve um peso molecular de 68KDa relatado eo peso da média de peso molecular obtidos a partir da medição foi 63.3KDa. Um valor dn / dc de 0.140ml / g foi utilizado para as medições.
Figura 2. Enredo Debye para Dextran na água.
O software permite Nano recolha de dados de distribuição de tamanho de partícula utilizando espalhamento de luz dinâmico, bem como a medição absoluta de intensidade para análise do peso molecular. Isto permite a determinação da modalidade da amostra antes da medição do peso molecular. Isso é importante para determinar a limpeza das amostras antes da análise. Figura 3 é a distribuição de tamanho de intensidade obtidos a partir da concentração de ações da solução de dextran (10mg/ml). A amostra tinha um diâmetro zaverage (o diâmetro médio com base na intensidade da luz dispersa) de 13.5nm. A distribuição monomodal obtidos confirmam que não houve agregados presentes. O peso molecular obtidos a partir de espalhamento de luz é o peso-médio e, portanto, a presença de qualquer agregados contribuem para este valor.
Figura 3. Distribuição de tamanho de Intensidade de dextran em água (10mg/ml).
O diâmetro médio de z-13.5nm pode ser usado para calcular uma massa molecular estimada de 64.8KDa usando um gráfico de calibração empírica desenvolvida por Malvern Instruments. Esta estimativa de peso molecular está disponível no software Nano e é útil para verificar os dados experimentais obtidos.
Conclusões
O Nano Zetasizer é o único instrumento comercial capaz de medir o tamanho, peso zeta potencial e molecular em uma unidade única e compacta. A incorporação da ENE ™ óptica dá a sensibilidade necessária para a medição de muito pequeno, amostras fracamente dispersão ea determinação do peso molecular. Além disso, o uso de detecção de backscatter permite a medição da concentração, as amostras opacas sem a necessidade de diluição.
Fonte: "Determinações Peso Molecular de Polímeros e Polissacarídeos Usando o Zetasizer Nano System", Nota de Aplicação por Malvern Instruments.
Para mais informações sobre essa fonte por favor visite Malvern Instruments Ltd (Reino Unido) ou Malvern Instruments (EUA) .