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Di fondo
Denaturazione delle proteine
Luce Scattering dinamico per la caratterizzazione delle proteine
La proteina Punto di fusione
Fattori che influenzano il punto di fusione delle proteine
Il Malvern Zetasizer Nano sistema
Di fondo
Le proteine sono composte da catene polipeptidiche, sintetizzate all'interno della cellula da un pool di 20 diversi tipi di amminoacidi. In contrasto con polimeri artificiali e bobina casuale biologico, catene polipeptidiche della proteina sono piegati in unico 3-strutture tridimensionali nello stato di natura. Queste strutture sono stabilizzate da una combinazione di interazioni elettrostatiche e idrofobiche, insieme con la formazione di legami idrogeno multipli tra le catene laterali degli aminoacidi all'interno della struttura.
Denaturazione delle proteine
Le proteine si sono evoluti per svolgere funzioni specifiche all'interno dei sistemi biologici, come catalizzare reazioni e il trasporto di piccole molecole o ioni. Questa funzionalità richiede un elevato grado di flessibilità all'interno della struttura della proteina. Come tale, le interazioni stabilizzare la struttura delle proteine sono appena sufficiente a mantenere la struttura all'interno di una ristretta gamma di condizioni ambientali. Se le condizioni sono la soluzione al di fuori di questo intervallo, ad esempio attraverso un cambiamento del pH o della temperatura, denaturazione entropicamente guidato o in atto può avvenire rapidamente. Quando denaturazione si verifica, le piccole dimensioni della proteina è aumentata fino ad un valore coerente con un polimero bobina casuale dello stesso peso molecolare. In assenza di caotropico (divieto di aggregazione) gli agenti, inter-polimero interazioni idrofobiche possono rapidamente portare alla aggregazione non specifica delle catene polipeptidiche denaturato. Una rappresentazione del processo di denaturazione, insieme con la successiva modifica delle dimensioni è mostrato in Figura 1.
Figura 1. Schematica in dettaglio il processo di denaturazione delle proteine e la successiva modifica delle dimensioni idrodinamica indicato dal diametro del cerchio pieno.
Luce Scattering dinamico per la caratterizzazione delle proteine
Dinamica dispersione della luce (DLS) è stato a lungo utilizzato come strumento di caratterizzazione delle proteine. In DLS, il moto browniano delle particelle viene misurata, e la dimensione idrodinamica è calcolato utilizzando l'equazione di Stokes-Einstein. La sensibilità del DLS è sufficiente per distinguere i diversi stati di proteine oligomeriche e quaternaria, ed è ideale per il monitoraggio della stabilità della struttura delle proteine alle condizioni di denaturazione.
La proteina Punto di fusione
Il punto di fusione di proteine (TM) è definita come la temperatura alla quale la proteina denatura. I cambiamenti nella dimensione che accompagna la denaturazione proteica è facilmente identificabile con tecniche DLS. Si consideri la Figura 2 per esempio, che mostra la dipendenza della temperatura Z-Diametro medio e l'intensità di scattering per l'ovoalbumina in tampone fosfato (PBS), misurato con una ZS Nano Zetasizer . A temperature inferiori a 71 ° C, la dimensione e l'intensità di scattering sono costanti, il che suggerisce una struttura stabile terziario. A 71 ° C e superiori, sia la dimensione e l'intensità dispersione aumentano in modo esponenziale con la temperatura, che indicano la presenza di aggregati denaturato.
Figura 2. Punto traccia di fusione e isteresi per l'ovoalbumina in PBS.