Caratterizzazione di Punto di fusione delle Proteine Facendo Uso del Sistema Nano di Zetasizer dagli Strumenti di Malvern

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Sfondo
Denaturazione delle Proteine
Scattering Leggero Dinamico per la Caratterizzazione delle Proteine
Il Punto di fusione della Proteina
Fattori che Pregiudicano il Punto di fusione delle Proteine
Il Sistema Nano di Malvern Zetasizer

Sfondo

Le Proteine sono composte di catene del polipeptide, sintetizzato all'interno della cella da un raggruppamento di 20 tipi differenti dell'amminoacido. Contrariamente ai polimeri biologici della spirale artificiale e casuale, le catene del polipeptide della proteina profilatura nelle 3 strutture dimensionali uniche nello stato natured. Queste strutture sono stabilizzate tramite una combinazione di interazioni elettrostatiche ed idrofobe, con la formazione di legami idrogeni multipli fra le catene laterali degli amminoacidi all'interno della struttura.

Denaturazione delle Proteine

Le Proteine sono state evolute per eseguire le funzioni specifiche all'interno dei sistemi biologici, come la catalisi delle reazioni e trasporto le molecole o degli ioni piccoli. Questa funzionalità necessita un grande grado di flessibilità all'interno della struttura della proteina. Come tale, le interazioni che stabilizzano la struttura della proteina sono solo sufficienti per mantenere la struttura all'interno di una gamma ristretta di condizioni ambientali. Se gli stati della soluzione sono fuori di questo intervallo, per esempio attraverso un cambiamento nel pH o nella temperatura, la denaturazione o lo spiegamento entropically determinata può accadere rapidamente. Quando la denaturazione accade, il di piccola dimensione della proteina è aumentato ad un valore coerente con un polimero casuale della spirale dello stesso peso molecolare. In assenza (aggregazione che proibisce) degli agenti chaotropic, le interazioni idrofobe del inter polimero possono piombo rapidamente all'aggregazione non specifica delle catene denaturate del polipeptide. Una rappresentazione del trattamento di denaturazione, con il cambiamento successivo nella dimensione è indicata nella Figura 1.

Figura 1. Disegno Schematico che dettaglia il trattamento di denaturazione della proteina ed il cambiamento successivo nella dimensione idrodinamica indicata dal diametro del cerchio solido.

Scattering Leggero Dinamico per la Caratterizzazione delle Proteine

Lo scattering leggero Dinamico (DLS) lungamente è stato usato come strumento di caratterizzazione delle proteine. In DLS, il moto Browniano delle particelle è misurato e la dimensione idrodinamica è calcolata facendo uso dell'equazione di Rifornire-Einstein. La sensibilità di DLS è sufficiente per distinguere gli stati oligomerici e quaternari differenti della proteina ed idealmente è adatta per il video della stabilità della struttura della proteina a denaturare le circostanze.

Il Punto di fusione della Proteina

Il punto di fusione della proteina (TM) è definito come la temperatura a cui la proteina denatura. Il cambiamento nella dimensione che accompagna la denaturazione della proteina è identificato facilmente facendo uso delle tecniche di DLS. Consideri Figura 2 per esempio, che mostra alla temperatura l'intensità Z-Media dipendente di scattering e del diametro per Ovalbumina in salino tamponato con i fosfati (PBS) misurato con uno Zetasizer ZS Nano. Alle temperature di meno che 71°C, la dimensione e l'intensità di scattering sono costante, suggerente una struttura terziaria stabile. A 71°C e più alto, sia la dimensione che l'intensità di scattering aumentano esponenzialmente con la temperatura, indicante la presenza di cumuli denaturati.

Figura 2. traccia ed isteresi di Punto di fusione per Ovalbumina in PBS.

Fattori che Pregiudicano il Punto di fusione delle Proteine

A causa della sequenza primaria unica degli amminoacidi connessi con i tipi specifici della proteina, i punti di fusione possono differire significativamente. Le Soluzioni condiziona, per esempio pH e concentrazione nel sale ed inviano le modifiche di traduzione, per esempio la glicosilazione, può anche avere una profonda influenza sulla stabilità della struttura della proteina e quindi della temperatura di fusione. Le misure di Punto di fusione poi sono un punto importante nella caratterizzazione totale della proteina bersaglio, specialmente se la proteina è destinata ad integrazione in un prodotto farmaceutico o in una formulazione. Figura 3 mostra le tracce di punto di fusione per una serie di proteine in PBS. Le misure automatizzate sono state raccolte con uno Zetasizer ZS Nano, facendo uso di una rampa incrementale della temperatura 1°C e di un tempo minuto di equilibrio 3 ad ogni temperatura di misura.

Figura 3. tracce di Punto di fusione e valori del TM per una serie di proteine in PBS.

Il Sistema Nano di Malvern Zetasizer

Lo Zetasizer ZS Nano dagli Strumenti di Malvern è il primo strumento commerciale per comprendere il hardware ed il software per le misure leggere dinamiche, statiche ed elettroforetiche combinate di scattering, danti al ricercatore una vasta gamma di beni del campione, compreso la dimensione, il peso molecolare ed il potenziale Zeta. Il sistema specificamente è stato destinato per soddisfare le richieste basse del volume di campione e di concentrazione connesse tipicamente con le applicazioni farmaceutiche e biomolecolari, con i requisiti di alta concentrazione delle applicazioni colloidali. La Soddisfazione della questa miscela unica dei requisiti faceva via l'integrazione di un sistema ottico di backscatter e della progettazione di una camera novella delle cellule. In conseguenza di queste funzionalità, le specifiche Nane di Zetasizer ZS per la dimensione del campione e la concentrazione superano quelle per qualunque altro strumento disponibile nel commercio di DLS, con un intervallo di grandezza di 0.6nm a 6um e un intervallo di concentrazione di lisozima 0.1mg/mL a p/V di 40%. Come premio aggiunto, il hardware Nano di Zetasizer ZS è auto che ottimizza ed il software comprende “una misura unica di un clic„, analizza e riferisce la funzionalità destinata per minimizzare la nuova curva di apprendimento dell'utente.

Date Added: May 9, 2005 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 01:28

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