De Karakterisering die van het Smeltpunt van Proteïnen het Nano Systeem Zetasizer Van Instrumenten Malvern Met Behulp Van

Besproken Onderwerpen

Achtergrond
Denaturatie van Proteïnen
Het Dynamische Lichte Verspreiden zich voor Karakterisering van Proteïnen
Het Eiwit Smeltpunt
Factoren die het Smeltpunt van Proteïnen Beïnvloeden
Het Nano Systeem van Malvern Zetasizer

Achtergrond

De Proteïnen zijn samengesteld die uit polypeptidekettingen, binnen de cel van een pool van 20 verschillende aminozuurtypes worden samengesteld. In tegenstelling tot kunstmatige en willekeurige rol biologische polymeren, zijn de het polypeptidekettingen van de proteïne gevouwen in unieke 3 dimensionale structuren in natured staat. Deze structuren worden gestabiliseerd door een combinatie elektrostatische en hydrophobic interactie, samen met de vorming van veelvoudige waterstofbanden tussen de zijketens van de aminozuren binnen de structuur.

Denaturatie van Proteïnen

De Proteïnen werden geëvolueerd om specifieke functies binnen biologische systemen uit te oefenen, zoals het katalyseren van reacties en het vervoeren van kleine molecules of ionen. Deze functionaliteit vergt een grote graad van flexibiliteit binnen de structuur van de proteïne. Als dusdanig, volstaan de interactie die de eiwitstructuur stabiliseren enkel om de structuur binnen een smalle waaier van milieuvoorwaarden te handhaven. Als de oplossingsvoorwaarden buiten dit gamma zijn, b.v. door een verandering in pH of de temperatuur, kan de entropically gedreven denaturatie of het openen snel voorkomen. Wanneer de denaturatie voorkomt, wordt de kleine grootte van de proteïne verhoogd tot een waarde verenigbaar met een willekeurig rolpolymeer van het zelfde moleculegewicht. In afwezigheid van chaotropic (samenvoeging die verbieden) agenten, kunnen de inter-polymeer hydrophobic interactie snel tot niet-specifieke samenvoeging van de gedenatureerde polypeptidekettingen leiden. Een vertegenwoordiging van het denaturatieproces, wordt samen met de verdere verandering in grootte getoond in Figuur 1.

Figuur 1. Schema die het eiwitdenaturatieproces en de verdere verandering in hydrodynamische die grootte detailleren door de diameter van de stevige cirkel wordt vermeld.

Het Dynamische Lichte Verspreiden zich voor Karakterisering van Proteïnen

Het Dynamische lichte verspreiden zich is (DLS) lang gebruikt als eiwitkarakteriseringshulpmiddel. In DLS, wordt de Brownbeweging van de deeltjes gemeten, en de hydrodynamische grootte wordt berekend gebruikend de vergelijking op:stoken-Einstein. De gevoeligheid van DLS volstaat om verschillende oligomeric en quaternaire eiwitstaten te onderscheiden, en is ideaal gezien geschikt voor de controle van de stabiliteit van de eiwitstructuur aan het denatureren voorwaarden.

Het Eiwit Smeltpunt

Het eiwit smeltpunt (TM) wordt gedefinieerd als de temperatuur waarbij de proteïne denatureert. De verandering in grootte die de eiwitdenaturatie begeleidt wordt gemakkelijk geïdentificeerd gebruikend technieken DLS. Overweeg Figuur 2 bijvoorbeeld, die de temperatuur afhankelijke z-Gemiddelde diameter en verspreidende intensiteit voor Ovalbumin in fosfaat dat als buffer opgetreden zout toont (PBS) met een Zetasizer Nano ZS wordt gemeten. Bij temperaturen minder dan 71°C, zijn de grootte en de verspreidende intensiteit constant, voorstellend een stabiele tertiaire structuur. Bij 71°C en hoger, zowel de grootte als verspreidende intensiteitsverhoging exponentieel met temperatuur, die op de aanwezigheid van gedenatureerde complexen wijzen.

Figuur 2. Smeltpuntspoor en hysterese voor Ovalbumin in PBS.

Factoren die het Smeltpunt van Proteïnen Beïnvloeden

Wegens de unieke primaire opeenvolging van aminozuren verbonden aan specifieke eiwittypes, kunnen de smeltpunten beduidend verschillen. De voorwaarden van Oplossingen, b.v. pH en zoute concentratie, en de post vertalende wijzigingen, b.v. glycosylation, kunnen een duidelijke invloed op de stabiliteit van de eiwitstructuur ook hebben en vandaar de het smelten temperatuur. De smeltpuntmetingen dan zijn een belangrijke stap in de totale karakterisering van de doelproteïne, in het bijzonder als de proteïne voor integratie in een farmaceutisch product of formulering bestemd is. Figuur 3 toont de smeltpuntsporen voor een reeks proteïnen in PBS. De geautomatiseerde metingen werden verzameld met een Zetasizer Nano ZS, gebruikend a1°C stijgende temperatuurhelling en een 3 minieme evenwichtstijd bij elke metingstemperatuur.

Figuur 3. Smeltpuntsporen en TM waarden voor een reeks proteïnen in PBS.

Het Nano Systeem van Malvern Zetasizer

Zetasizer Nano ZS van Instrumenten Malvern is het eerste commerciële instrument om de hardware en de software voor gecombineerde dynamische, statische, en elektroforetische het lichte verspreiden te omvatten zich metingen, die de onderzoeker een brede waaier van steekproefeigenschappen geven, met inbegrip van de grootte, moleculegewicht, en zeta potentieel. Het systeem werd specifiek ontworpen om aan de lage concentratie en steekproefvolumevereisten te voldoen typisch verbonden aan farmaceutische en biomoleculaire toepassingen, samen met de hoge concentratievereisten voor colloïdale toepassingen. Het Tevredenstellen van deze unieke mengeling van vereisten werd verwezenlijkt via de integratie van een backscatter optisch systeem en het ontwerp van een nieuwe celkamer. Ten gevolge van deze eigenschappen, overschrijden de specificaties Zetasizer Nano ZS voor steekproefgrootte en concentratie die voor een ander in de handel verkrijgbaar instrument DLS, met een groottewaaier van 0.6nm tot 6um, en een concentratiewaaier van lypozyme 0.1mg/mL aan 40% w/v. Als toegevoegde bonus, is de hardware Zetasizer Nano ZS het zelf optimaliseren, en de software omvat een unieke die „één klikt“ maatregel, analyseert, en rapporteigenschap wordt ontworpen om de nieuwe gebruiker het leren kromme te minimaliseren.

Date Added: May 9, 2005 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 01:19

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit