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Temas Abordados
Fundo
Desnaturação de proteínas
Espalhamento de luz dinâmico para Caracterização de Proteínas
O ponto de fusão da proteína
Fatores que afetam o ponto de fusão de Proteínas
A Malvern Zetasizer Nano Sistema
Fundo
As proteínas são compostas de cadeias polipeptídicas, sintetizado dentro da célula de um conjunto de 20 diferentes tipos de aminoácidos. Em contraste com polímeros sintéticos e bobina aleatória biológicas, cadeias polipeptídicas da proteína são dobradas em única 3-dimensional estruturas no estado humorada. Estas estruturas são estabilizadas por uma combinação de interações eletrostáticas e hidrofóbicas, juntamente com a formação de múltiplas ligações de hidrogênio entre as cadeias laterais dos aminoácidos dentro da estrutura.
Desnaturação de proteínas
Proteínas foram desenvolvidos para executar funções específicas dentro dos sistemas biológicos, tais como catalisar reações e transporte de pequenas moléculas ou íons. Esta funcionalidade exige um elevado grau de flexibilidade na estrutura da proteína. Como tal, as interações estabilizar a estrutura da proteína são apenas suficientes para manter a estrutura dentro de uma estreita faixa de condições ambientais. Se as condições de solução estão fora deste intervalo, por exemplo, através de uma mudança no pH ou temperatura, desnaturação entropicamente conduzido ou desdobramento pode rapidamente ocorrer. Quando ocorre a desnaturação, o pequeno tamanho da proteína é aumentada para um valor consistente com um polímero bobina aleatória com o mesmo peso molecular. Na ausência de caotrópicos (agregação proibindo) os agentes, interações inter-polímero hidrofóbico pode levar rapidamente a não-específicos de agregação das cadeias polipeptídicas desnaturado. A representação do processo de desnaturação, juntamente com a posterior alteração no tamanho é mostrado na Figura 1.
Figura 1. Esquemático detalhando o processo de desnaturação de proteínas e consequente mudança de tamanho hidrodinâmico indicado pelo diâmetro do círculo sólido.
Espalhamento de luz dinâmico para Caracterização de Proteínas
Espalhamento de luz dinâmico (DLS) tem sido muito utilizado como uma ferramenta de caracterização de proteínas. Em DLS, o movimento browniano das partículas é medida, eo tamanho hidrodinâmico é calculado usando a equação de Stokes-Einstein. A sensibilidade do DLS é suficiente para distinguir diferentes estados de proteína oligomérica e quaternário, e é ideal para monitorar a estabilidade da estrutura da proteína a condições de desnaturação.
O ponto de fusão da proteína
O ponto de fusão de proteínas (TM) é definida como a temperatura na qual o desnatura proteínas. A alteração no tamanho que acompanha a desnaturação de proteínas é facilmente identificado através de técnicas DLS. Considere a Figura 2, por exemplo, que mostra a temperatura média de diâmetro Z-dependentes e intensidade de espalhamento para a ovalbumina em tampão fosfato salino (PBS) medido com uma ZS Zetasizer Nano . A temperaturas inferiores a 71 ° C, o tamanho e intensidade de espalhamento são constantes, sugerindo uma estrutura estável terciário. No 71 ° C e superior, tanto o tamanho e intensidade de espalhamento aumentam exponencialmente com a temperatura, indicando a presença de agregados desnaturado.
Figura 2. Trace Ponto de fusão e histerese para a ovalbumina em PBS.
Fatores que afetam o ponto de fusão de Proteínas
Devido à seqüência única primária de aminoácidos associados a tipos de proteína específica, pontos de fusão podem diferir significativamente. Soluções condições, por exemplo, pH e concentração de sal, e pós-translacionais modificações, por exemplo, glicosilação, também pode ter uma influência marcante sobre a estabilidade da estrutura da proteína e, consequentemente, a temperatura de fusão. Medições de ponto de fusão, então, são um passo importante na caracterização total da proteína-alvo, especialmente se a proteína está destinado para a integração de um produto farmacêutico ou formulação. A Figura 3 mostra os traços ponto de fusão para uma série de proteínas em PBS. As medições automatizadas foram coletados com um Nano Zetasizer ZS , usando uma rampa de 1 ° C de temperatura incremental e um tempo de equilíbrio 3 minutos em cada temperatura de medição.
Figura 3. Melting traços ponto e os valores TM para uma série de proteínas em PBS.
A Malvern Zetasizer Nano Sistema
O Zetasizer Nano ZS da Malvern Instruments é o primeiro instrumento comercial para incluir o hardware e software combinadas para medições de espalhamento dinâmico, estático e eletroforética luz, dando ao pesquisador uma ampla gama de propriedades da amostra, incluindo o tamanho, peso molecular e potencial zeta . O sistema foi projetado especificamente para atender a baixa concentração e os requisitos de volume de amostra tipicamente associados com aplicações farmacêuticas e biomolecular, juntamente com os requisitos alta concentração para aplicações coloidal. A satisfação deste mix exclusivo de requisitos foi realizado através da integração de um sistema de retroespalhamento óptico eo desenho de uma câmara de celular romance. Como conseqüência dessas características, o Zetasizer Nano ZS especificações para o tamanho da amostra e concentração superam os de qualquer outro instrumento DLS comercialmente disponíveis, com uma faixa de tamanho de 0.6Nm para 6um, e uma faixa de concentração de lisozima 0.1mg/mL a 40% w / v. Como um bônus adicional, o Zetasizer Nano ZS hardware é otimizar self, eo software inclui um único "um clique" medir, analisar, e apresentam relatório concebido para minimizar a curva de aprendizagem novo usuário.