Caracterização do Ponto de Derretimento das Proteínas Usando o Sistema Nano de Zetasizer dos Instrumentos de Malvern

Assuntos Cobertos

Fundo
Desnaturação das Proteínas
Dispersão de Luz Dinâmica para a Caracterização das Proteínas
O Ponto de Derretimento da Proteína
Factores que Afetam o Ponto de Derretimento das Proteínas
O Sistema Nano de Malvern Zetasizer

Fundo

As Proteínas são compor de correntes do polipeptídeo, sintetizado dentro da pilha de uma associação de 20 tipos diferentes do ácido aminado. Em contraste com polímeros biológicos da bobina sintética e aleatória, as correntes do polipeptídeo da proteína são dobradas em 3 estruturas dimensionais originais no estado natured. Estas estruturas são estabilizadas por uma combinação das interacções electrostáticas e hidrofóbicas, junto com a formação de ligações de hidrogênio múltiplas entre as correntes laterais dos ácidos aminados dentro da estrutura.

Desnaturação das Proteínas

As Proteínas foram evoluídas para executar funções específicas dentro dos sistemas biológicos, tais como a catalização de reacções e o transporte de moléculas ou de íons pequenos. Esta funcionalidade necessita um grande grau de flexibilidade dentro da estrutura da proteína. Como tal, as interacções que estabilizam a estrutura da proteína são apenas suficientes para manter a estrutura dentro de uma escala estreita de circunstâncias ambientais. Se as condições da solução são fora desta escala, por exemplo através de uma mudança no pH ou na temperatura, a desnaturação ou a revelação entropically conduzida podem rapidamente ocorrer. Quando a desnaturação ocorre, o tamanho pequeno da proteína está aumentado a um valor consistente com um polímero aleatório da bobina do mesmo peso molecular. Na ausência (agregação que proibe) dos agentes chaotropic, as interacções hidrofóbicas do inter-polímero podem rapidamente conduzir à agregação não específica das correntes desnaturadas do polipeptídeo. Uma representação do processo da desnaturação, junto com a mudança subseqüente é mostrada em tamanho em Figura 1.

Figura 1. Diagrama Esquemático que detalha o processo da desnaturação da proteína e a mudança subseqüente no tamanho hidrodinâmico indicado pelo diâmetro do círculo contínuo.

Dispersão de Luz Dinâmica para a Caracterização das Proteínas

A dispersão de luz Dinâmica (DLS) tem sido usada por muito tempo como uma ferramenta da caracterização da proteína. Em DLS, o movimento Brownian das partículas é medido, e o tamanho hidrodinâmico é calculado usando a equação de Avivar-Einstein. A sensibilidade de DLS é suficiente para distinguir estados oligomeric e quaternários diferentes da proteína, e é serida idealmente monitorando a estabilidade da estrutura da proteína a desnaturar circunstâncias.

O Ponto de Derretimento da Proteína

O ponto de derretimento da proteína (TM) é definido como a temperatura em que a proteína desnatura. A mudança que acompanha a desnaturação da proteína é identificada em tamanho facilmente usando técnicas de DLS. Considere Figura 2 por exemplo, que mostra à temperatura o diâmetro Z-Médio dependente e intensidade da dispersão para a Albumina Do Ovo em salino protegido fosfato (PBS) medido com um Zetasizer ZS Nano. Em temperaturas menos do que 71°C, o tamanho e a intensidade da dispersão são constante, sugerindo uma estrutura terciária estável. Em 71°C e mais alto, o tamanho e dispersão do aumento da intensidade exponencial com a temperatura, indicando a presença de agregados desnaturados.

Figura 2. traço e histerese do ponto de Derretimento para a Albumina Do Ovo em PBS.

Factores que Afetam o Ponto de Derretimento das Proteínas

Devido à seqüência preliminar original dos ácidos aminados associados com os tipos específicos da proteína, os pontos de derretimento podem diferir significativamente. As Soluções condicionam, por exemplo pH e concentração de sal, e afixam alterações translational, por exemplo o glycosylation, pode igualmente ter uma influência marcada na estabilidade da estrutura da proteína e daqui da temperatura de derretimento. As medidas do ponto de Derretimento são então uma etapa importante na caracterização total da proteína do alvo, particularmente se a proteína é destinada para a integração em um produto farmacêutico ou em uma formulação. Figura 3 mostra os traços do ponto de derretimento para uma série de proteínas em PBS. As medidas automatizadas foram recolhidas com um Zetasizer ZS Nano, usando uma rampa incremental da temperatura 1°C e uma estadia minuto do equilíbrio 3 em cada temperatura da medida.

Figura 3. traços do ponto de Derretimento e valores do TM para uma série de proteínas em PBS.

O Sistema Nano de Malvern Zetasizer

O Zetasizer ZS Nano dos Instrumentos de Malvern é o primeiro instrumento comercial para incluir o hardware e o software para as medidas dinâmicas, estáticas, e electrophoretic combinadas da dispersão de luz, dando ao pesquisador uma vasta gama de propriedades da amostra, incluindo o tamanho, o peso molecular, e o potencial do zeta. O sistema foi projectado especificamente cumprir as baixas exigências do volume da concentração e de amostra associadas tipicamente com as aplicações farmacêuticas e biomoleculares, junto com as exigências da concentração alta para aplicações coloidais. Satisfazer esta mistura original de exigências era realizada através da integração de um sistema óptico do backscatter e do projecto de uma câmara nova da pilha. Em consequência destas características, as especificações Nano de Zetasizer ZS para o tamanho da amostra e a concentração excedem aquelas para todo o outro instrumento disponível no comércio de DLS, com uma escala do tamanho de 0.6nm a 6um, e uma escala de concentração do lysozyme 0.1mg/mL ao W/v. de 40%. Como um bônus adicionado, o hardware Nano de Zetasizer ZS é auto que aperfeiçoa, e o software inclui de “uma medida original um clique”, analisa, e relata a característica projetada minimizar a curva de aprendizagem nova do usuário.

Date Added: May 9, 2005 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 01:43

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