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Fondo
Sperimentale
Preparazione del campione
Determinazione della dimensione delle particelle
Risultati
Fondo
Nel 1934, Palmer per primo descrisse la separazione di ß-lattoglobulina (ß-Lg) dalla frazione siero di latte bovino. Questa scoperta è stata fatta 50 anni prima che la struttura attuale potrebbe essere chiarito attraverso cristallografia a raggi X. .. La maggior parte di questi centro studi intorno calore indotta dal momento che questo è di grande interesse e importanza per la trasformazione dei prodotti lattiero-caseari. Nonostante gli anni di ricerca, la funzione specifica di ß-lattoglobulina deve ancora essere completamente compresa. Lo scopo di questo lavoro è quello di fornire uno studio di ß-Lg aggregazione elettrostatici a bassa forza ionica (I) ed a valori di pH al di sotto del punto isoelettrico (PI), dove l'aggregazione avviene ad una velocità abbastanza lento per essere valutati da quasi-elastica di luce scattering (QELS).
Sperimentale
Preparazione del campione
ß-Lg A & B, acquistati da Sigma-Aldrich ed usati senza ulteriore purificazione, è stato sciolto in 4,5 NaCl preparato da Milli-Q acqua. Il sciolto ß-Lg è stato poi elevato a pH 9, al fine di dissociare la proteina nella sua specie monomerica. Un uguale volume di NaCl 4,5 mm è stato preparato che contiene la giusta quantità di HCl 0.1M per portare le soluzioni combinate per il pH obiettivo e la concentrazione di 4,2 e 1mg/mL rispettivamente. Entrambe le soluzioni sono state filtrate (0,2 micron filtri, Sartorius AG, Germania), e poi mescolati immediatamente prima dell'analisi.
Determinazione della dimensione delle particelle
Distribuzioni di dimensioni della ß-Lg aggregati sono stati determinati utilizzando il Malvern Zetasizer Nano ZS . Tempi di correlazione erano sette secondi per correre e tre prove per ogni misura. QELS è stato utilizzato per determinare la distribuzione delle dimensioni più di cinquanta minuti.
Risultati
La figura 1 mostra la distribuzione delle dimensioni di intensità raccolti durante l'esperimento di cinetica di tempo (t) = 0. Come risulta evidente qui, i risultati indicano che QELS, ß-Lg aggregati in due popolazioni distinte dimensioni quasi immediatamente.
Figura 1. Dimensione distribuzione intensità per 1mg/mL ß-Lg a 4,5 mm NaCl a pH 4.2 al tempo = 0.
La popolazione di dimensioni più piccole ha un diametro di circa 5.4nm idrodinamica. Utilizzando una massa nota vs rapporto dimensioni per le proteine globulari, la formula 1, il peso molecolare della proteina 5.4nm è di circa 35 kDa, coerente con la forma dimerica della proteina ß-Lg.
La traccia cinetica per l'esperimento è illustrato nella figura 2, che indica il diametro intensità e la Z-media in funzione del tempo sperimentale.
Figura 2. Traccia cinetica 1.0mg/mL ß-Lg a 4,5 mm NaCl a pH 4.2.
L'intensità di scattering è approssimativamente proporzionale alla concentrazione e il quadrato del peso molecolare, e quindi è molto sensibile alla formazione di aggregati di ordine superiore. Lo Z-media diametro è il diametro medio del complesso delle particelle, e deriva dalla pendenza della forma linearizzata della funzione di correlazione (metodo Cumulants). Come si vede nella figura 2, la formazione del aggregati di ordine superiore si verifica nei primi 20-25 minuti dell'esperimento. In tempi più lunghi, l'intensità di scattering è relativamente costante, suggerendo che dimero-aggregato equilibrio è stato raggiunto. Stabilizzazione del complessivo ordine superiore a tempi più lunghi è evidente anche nella figura 3, che mostra selezionato distribuzioni intensità dimensioni dall'esperimento cinetica.
Figura 3. Selezionati distribuzioni di intensità formato dalla ß-Lg esperimento cinetica.
Una diminuzione della quantità relativa di dimero è stata osservata anche nel corso del tempo l'esperimento. Alle condizioni iniziali, mostrata in figura 1, la concentrazione dimero rappresentato il 80% dell'intensità di scattering. Al termine del percorso sperimentale, il contributo di intensità di scattering dal dimero si era stabilizzato a circa il 10% del totale (vedi figura 4). Come si vede in Figura 4, un aumento dell'intensità di scattering e di stabilizzazione dimensioni dell'aggregato super-potrebbe anche essere visto nel corso del tempo. L'intensità di scattering dell'aggregato aumentata dal 20% al 90% durante la corsa, con la dimensione dell'aggregato in ultima analisi, è stabilizzato a circa 425nm.
Figura 4. Dipendenti dal tempo distribuzioni di intensità dimensioni per ß-Lg a 4,5 mm NaCl a pH 4.2.
Nota: Un elenco completo delle referenze è disponibile facendo riferimento al documento originale.
Fonte: "L'aggregazione di β-lattoglobulina", Application Note di Malvern Instruments.
Per ulteriori informazioni su questa fonte si prega di visitare Malvern Instruments Ltd (UK) o Malvern Instruments (USA) .