Agregação Electrostática da â-Lactoglobulina Usando a Dispersão de Luz Quase-Elétrica por Malvern

Assuntos Cobertos

Fundo
Experimental
     Preparação da Amostra
     Determinação do Tamanho de Partícula
Resultados

Fundo

Em 1934, Palmer descreveu primeiramente a separação da ß-Lactoglobulina (ß-Lg) da fracção do soro do leite bovino. Esta descoberta foi feita cinqüênta anos antes que a estrutura real poderia ser explicada com o cristalografia do Raio X. A maioria destes estuda o centro em torno da agregação induzida calor desde que esta é do grandes interesse e importância ao processamento dos produtos lácteos. Apesar dos anos de pesquisa, a função específica da ß-Lactoglobulina deve ser compreendida ainda completamente. A finalidade deste trabalho é fornecer um estudo da agregação ß-Lg electrostática na baixa concentração iónica (i) e em valores de pH abaixo do ponto isoeléctrico (pI) onde a agregação ocorre em uma taxa lenta bastante para ser avaliada pela dispersão de luz quase-elástica (QELS).

Experimental

Preparação da Amostra

O ß-Lg A&B, comprado do Sigma Aldrich e usado sem purificação mais adicional, foi dissolvido no NaCl de 4.5mM preparado da água de Milli-Q. O ß-Lg dissolvido foi aumentado então para o pH 9 a fim dissociar a proteína em sua espécie monomeric. Um volume igual de NaCl de 4.5mM foi preparado que contem a quantidade apropriada de HCl de 0.1M para trazer as soluções combinadas ao pH do alvo e à concentração de 4,2 e de 1mg/mL respectivamente. Ambas As soluções foram filtradas (0,2 filtros do µm, Sartório AG, Alemanha), e misturadas então imediatamente antes da análise.

Determinação do Tamanho de Partícula

As distribuições de Tamanho dos agregados ß-Lg eram determinadas usando o Malvern Zetasizer ZS Nano. Os tempos da Correlação eram sete segundos pela corrida e as três corridas pela medida. QELS foi usado para determinar distribuições de tamanho sobre cinqüênta minutos.

Resultados

Figura 1 mostra a distribuição de tamanho da intensidade recolhida durante a experiência cinética no tempo (t) = 0. Como evidente aqui, os resultados de QELS indicam aquele, agregados ß-Lg em duas populações distintas do tamanho quase imediatamente.

Figura 1. distribuição de tamanho da Intensidade para 1mg/mL ß-Lg no NaCl de 4.5mM no pH 4,2 no tempo = 0.

A população menor do tamanho tem um diâmetro hidrodinâmico cerca de 5.4nm. Usando uma massa conhecida contra o relacionamento do tamanho para proteínas globulares, mostrado na Equação 1, o peso molecular da proteína 5.4nm é o kDa aproximadamente 35, consistente com o formulário dimeric da proteína ß-Lg.

O traço cinético para a experiência é mostrado em Figura 2, que mostra o diâmetro do intensidade e o Z-Médio em função do tempo experimental.

Figura 2. traço Cinético de 1.0mg/mL ß-Lg no NaCl de 4.5mM no pH 4,2.

A intensidade da dispersão é aproximadamente proporcional à concentração e ao quadrado do peso molecular, e é daqui bastante sensível à formação de uns agregados mais altos do pedido. O diâmetro Z-Médio é o diâmetro médio do conjunto de partículas, e é derivado da inclinação do formulário tornado linear da função de correlação (método dos Cumulants). Como visto em Figura 2, a formação do agregado mais alto do pedido ocorre nos primeiros 20-25 minutos da experiência. Em umas horas mais longas, a intensidade da dispersão é relativamente constante, sugerindo que o equilíbrio do dímero-agregado esteja conseguido. A Estabilização do agregado mais alto do pedido em umas horas mais longas é igualmente evidente em Figura 3, que mostra distribuições de tamanho selecionadas da intensidade da experiência cinética.

Figura 3. Seleccionou distribuições de tamanho da intensidade da experiência ß-Lg cinética.

Uma diminuição na quantidade relativa de dímero foi observada igualmente sobre o curso do tempo da experiência. Nas circunstâncias iniciais, mostradas em Figura 1, a concentração do dímero esclareceu 80% da intensidade da dispersão. No final da corrida experimental, a contribuição para a dispersão da intensidade pelo dímero tinha estabilizado em aproximadamente 10% do total (veja Figura 4). Como visto em Figura 4, um aumento em dispersar a estabilização da intensidade e do tamanho do agregado super podia igualmente ser considerado ao longo do tempo. A intensidade da dispersão do agregado aumentado de 20% a 90% durante a corrida, com o tamanho do agregado estabilizado finalmente em aproximadamente 425nm.

Figura 4. distribuições de tamanho dependentes da intensidade do Tempo para o ß-Lg no NaCl de 4.5mM no pH 4,2.

Nota: Uma lista completa de referências está disponível com referência ao original original.

Source: “Agregação da β-Lactoglobulina”, Nota de Aplicação por Instrumentos de Malvern.

Para obter mais informações sobre desta fonte visite por favor Instrumentos Ltd de Malvern (REINO UNIDO) ou Instrumentos de Malvern (EUA).

Date Added: May 9, 2005 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 01:43

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