Ämnen som tas upp
Bakgrund
Experimentell
Provberedning
Fastställande av partikelstorlek
Resultat
Bakgrund
År 1934 beskrev Palmer först separation av ß-lactoglobulin (SS-LG) från vasslen bråkdel av komjölk. Denna upptäckt gjordes femtio år innan själva struktur skulle kunna belysas genom röntgenkristallografi .. Majoriteten av dessa studier center runt värme inducerad aggregation eftersom detta är av stort intresse och betydelse för bearbetningen av mejeriprodukter. Trots år av forskning, är den specifika funktion av ß-laktoglobulin ännu inte helt klarlagd. Syftet med detta arbete är att ge en studie av ß-LG elektrostatisk aggregering vid låg jonstyrka (I) och vid pH värden under isoelektriska punkt (PI) där aggregering sker i en takt långsam nog att utvärderas av kvasi-elastiskt ljus spridning (QELS).
Experimentell
Provberedning
ß-LG A & B, köpt från Sigma-Aldrich och användas utan ytterligare rening, var löst i 4,5 mm NaCl beretts av Milli-Q Water. Den upplösta ß-LG var då upp till pH 9 för att ta avstånd proteinet i sin monomera arter. En lika stor volym 4,5 mm NaCl var utarbetas som innehåller lämplig mängd 0,1 miljoner HCl för att få den kombinerade lösningar för att målet pH och koncentration av 4,2 och 1mg/ml respektive. Båda lösningarna har filtrerats (0,2 ìm filter, Sartorius AG, Tyskland), och sedan blandas omedelbart före analys.
Fastställande av partikelstorlek
Storlek fördelningar av SS-LG aggregat bestämdes med hjälp av Malvern Zetasizer Nano ZS . Korrelation tiderna var sju sekunder per körning och tre körningar per mätning. QELS användes för att fastställa storleken distributioner över femtio minuter.
Resultat
Figur 1 visar fördelningen intensiteten storlek som samlats in under den kinetiska experimentet vid tiden (t) = 0. Som framgår här, QELS resultat indikerar att ß-LG aggregat i två olika stora populationer nästan omedelbart.
Figur 1. Intensitet storleksfördelning för 1mg/ml ß-LG i 4,5 mm NaCl vid pH 4,2 vid tiden = 0.
Den mindre storleken befolkningen har en hydrodynamisk diameter på cirka 5.4nm. Med hjälp av en känd mängd kontra storlek relation för globulära proteiner, som visas i Ekvation 1 är molekylvikt 5.4nm protein ca 35 kDa, i överensstämmelse med dimeriskt formen av SS-lg protein.
Den kinetiska spår för experimentet visas i figur 2, som visar intensitet och Z-genomsnittlig diameter som funktion av experimentell tid.
Figur 2. Kinetisk spår av 1.0mg/mL SS-LG i 4,5 mm NaCl vid pH 4,2.
Den spridningen intensitet är ungefär proportionell mot koncentrationen och kvadraten på molekylvikt, och är därmed ganska känslig för bildandet av högre ordning aggregat. Z-medeldiameter är medeldiametern i ensemblen av partiklar, och härrör från lutningen på linjäriserade form korrelationsfunktion (Cumulants metod). Som framgår av Figur 2, sker bildandet av högre ordning samlade under de första 20-25 minuterna av försöket. Vid längre tider är spridningen intensiteten relativt konstant, vilket tyder på att dimer-aggregerade balans har uppnåtts. Stabilisering av högre ordning samlade på längre tid syns också i figur 3 som visar utvalda distributioner intensitet storlek från den kinetiska experiment.
Figur 3. Intensitet storlek utdelningar från SS-LG kinetiska experiment.
En minskning i den relativa mängd dimer observerades också under tiden loppet av experimentet. Vid de ursprungliga villkor som visas i figur 1, stod dimer koncentration för 80% av spridningen intensitet. Vid avslutningen av den experimentella springa, hade bidragit till spridningen intensitet som dimer stabiliserats på cirka 10% av den totala (se Figur 4). Som framgår av Figur 4, kan en ökad spridning intensitet och storlek stabilisering av super samlade också ses över tid. Spridningen intensiteten av det sammanlagda ökat från 20% till 90% under loppet, med storleken på den samlade slutligen stabiliseras vid ca 425nm.
Figur 4. Tidsberoende intensitet storlek distributioner för ß-LG i 4,5 mm NaCl vid pH 4,2.
OBS: En komplett lista över referenser finns tillgängliga genom att hänvisa till det ursprungliga dokumentet.
Källa: "Aggregering av β-lactoglobulin" Application Note av Malvern Instruments.
För mer information om denna källa besök Malvern Instruments Ltd (Storbritannien) eller Malvern Instruments (USA) .