Protein Kristallisation, die Durch die Anwendung der Dynamischen Lichtstreuung Unter Verwendung des Geräts Von Malvern-Instrumenten Mit Filter Versieht

Themen Umfaßt

Hintergrund
     Wachstum von Protein-Kristallen
     Der Zweite Virial-Koeffizient
     Maß des Zweiten Virial-Koeffizienten
     Der Zweite Virial-Koeffizient und das Optimale Kristallwachstum
Probleme Verbundene Bestimmung des Zweiten Virial-Koeffizienten
     Dynamische Lichtstreuung
     Dynamische Lichtstreuungs-und Teilchengröße-Bestimmung
     Dynamische Lichtstreuung und Anhäufung
Dynamische Lichtstreuung und Kristallisations-Screening
Endo-Pg I Mit Filter Versehend
     Dynamische Lichtstreuung und Endo-Pg I Mit Filter Versehend
Nano-Anlage Zetasizer

Hintergrund

Im Anfang der 90er wurde die dynamische (DLS) Lichtstreuung als Screeninghilfsmittel für Kristallographie eingeführt. In den letzten zehn Jahren ist DLS breit in dieser Rolle angenommen geworden, und dynamische Lichtstreuungsinstrumente werden jetzt routinemäßig in Röntgenstrahlkristallographielabors integriert. Ein geläufiges Missverständnis jedoch, ist, dass DLS einem mitteilen kann, welche Proben wahrscheinlich sind, Kristalle zu erbringen. In der Praxis wird DLS passender als Hilfsmittel für Proben heraus mit filter versehen verwendet, die unwahrscheinlich sind, Kristalle zu erbringen. In diesem Artikel adressieren wir den subtilen Unterschied bezüglich dieser Punkte und prüfen den Wert von Lichtstreuungstechniken als Kristallscreeninghilfsmittel.

Wachstum von Protein-Kristallen

Die Kinetik, die Schritt in der Auflösung von Kristallstrukturen bestimmt, kennzeichnet die optimalen Bedingungen für Kristallwachstum der hohen Qualität. Es gibt eine Vielzahl Reagenzien für das Erzeugen der „Suppen“ von, welchen Kristallen der hohen Qualität gewachsen werden. Jedoch neigen alle Rezepte, Proteinbesondere zu sein, und während, eine Lieblingsmischung zu ändern, um einem neuen Proteinziel zu entsprechen der Standardanflug meistens ist spielt Glück eine beträchtliche Rolle in der Generation von Proteinkristallen der hohen Qualität.

Der Zweite Virial-Koeffizient

Der zweite virial Koeffizient (a)2 ist ein thermodynamisches Eigentum, welches die Interaktionsstärke zwischen dem Protein und dem Lösungsmittel beschreibt. Für Proteinlösungsmittel Anlagen mit mag2 A > 0, das Protein „das Lösungsmittel“ mehr als selbst und neigt, löslich zu sein. Wenn A2 = 0, das Lösungsmittel als Thetalösungsmittel beschrieben wird und anzeigt, dass Partikellösungsmittel Interaktionsstärke mit Partikelpartikel Interaktionsstärke gleichwertig ist. Wenn A2 << 0, das Protein „“ viel mehr als sich mag, neigt das Lösungsmittel und, in formlosen Niederschlag anzusammeln. Wenn A2 jedoch gerade etwas negativ ist, sind die Bedingungen für Kristallwachstum des Proteins an der Sättigung von Konzentrationen ideal (Abbildung 1).

Abbildung 1. Kristallwachstumserfolgskinetik als Funktion des 2. virial Koeffizienten (a)2.

Maß des Zweiten Virial-Koeffizienten

Der 2. virial Koeffizient wird gewöhnlich unter Verwendung der statischen Lichtstreuungstechniken (SLS) gemessen. Der Rayleigh-Ausdruck, der verwendet wird, um das Zerstreuen der Leuchte von den Partikeln zu beschreiben kleiner als die Wellenlänge sind der Vorfallleuchte, wird in Gleichung 1, wo K eine optische Konstante ist, C ist die Partikelkonzentration gegeben, ist M die Gewichtsmittlere molmasse, ist2 A der 2. virial Koeffizient, und Rè ist das Rayleigh-Verhältnis von zerstreut zur Vorfalllichtstärke.

(1)

Wie offensichtlich in Gleichung 1, sollte KC/Rè mit Konzentration, mit einem Abfangen linear sein, das 1/M und einer Steigung, die, gleich ist zu A. proportional ist.2

Der Zweite Virial-Koeffizient und das Optimale Kristallwachstum

Der Gebrauch von dem 2. virial Koeffizienten als Screeningparameter für optimale Kristallwachstumszustände war vorschlagen zuerst durch Wilson et al., der das Kristallisationsfenster als -0,8 x 10 >-4 A >2 -8,0 x 10 definierte-4 (Mol ml/g)2. Dieser Kristallisationsfenster- oder -kristallschlitz wird als Zone II in Abbildung 2 markiert, die die statischen Lichtstreuungsergebnisse für Lysozym bei verschiedenen Salzkonzentrationen im Essigsäurebuffer zeigt (pH 4).

Abbildung 2. Debye-Pläne für Lysozym bei verschiedenen NaCl-Konzentrationen im Essigsäurebuffer bei pH 4. Das graue Markieren in Zone II, den Kristallisationsschlitz, in dem -0,8 x 10 >-4 A >2 -8,0 x 10. definiert.-4

Probleme Verbundene Bestimmung des Zweiten Virial-Koeffizienten

Während crystallographers Erfolg unter Verwendung des Kristallisationsfensters genossen haben, um Bedingungen der optimalen Lösung, die Anzahl von Maßen, und folglich die benötigte Zeit festzulegen (aufwärts von 2 Stunden), A für2 ein einzelnes Lösungsmittel kann auszuwerten, besonders für die problematisch sein, die einen hohen Durchsatzanflug zum Proteinkristallscreening suchen.

Dynamische Lichtstreuung

DLS ist eine Technik, die zur statischen Lichtstreuung sich ergänzt, und kann an einer Zeitschuppe durchgeführt werden, die im Protokoll eher als Stunden gemessen wird. In DLS Intensität zerstreuend wird Fluktuieren über µs Zeitschuppen geüberwacht und aufeinander bezogen dann. Das Intensitätsfluktuieren ist eine Konsequenz des Partikelantrages, und das gemessene Eigentum in der Korrelationsanalyse ist die Verteilung von Diffusionskoeffizienten. Die Größe wird dann unter Verwendung der Schüren-Einstein-Gleichung berechnet (Eq. 2), wo RECHTS der hydrodynamische Radius ist, K ist die Boltzmann-Konstante, ist T die Temperatur, ist ç die zahlungsfähige Viskosität und D ist der Diffusionskoeffizient.

(2)

Dynamic Light Scattering and Particle Size Determination

Figure 3 shows a representative particle size distribution determined using DLS. Since the scattering intensity is ~ proportional to the particle molecular weight, DLS is very sensitive to aggregation and large impurities, even at low concentrations.

Figure 3. Representative DLS intensity particle size distribution.

As such, the technique is ideally suited for distinguishing samples that are unlikely to yield high quality crystals, due to the presence of impurities or non-specific aggregates, i.e. solutions residing in zone III of a Debye plot (Figure 2) where A2 << 0.

Dynamic Light Scattering and Aggregation

Figure 4 shows a comparison of the types of aggregation observed at both high and low concentration for typical protein samples, along with typical size distributions measured using DLS. The rule of thumb target for crystal screening using DLS is ~20% polydispersity (Pd), i.e. if the Pd < ~20% the sample is considered to be an ideal single population with no aggregates present. If the Pd > 20% on the other hand, the presence of non-specific aggregates, various oligiomeric states, and/or impurities decreases the likelihood of high quality crystal generation.

Figure 4. Schematic showing the types of aggregation observed at low and high concentration for typical protein samples. The A2 Zonen sind die, die in den Debye-Plänen einzeln aufgeführt werden, die in Abbildung 2 gezeigt werden, und die Korngrößenverteilungen sind Vertreter von denen, die für jede Zone bei den verdünnten Konzentrationen gemessen werden, die für die statischen und dynamischen Lichtstreuungsmaße verwendet werden. Beachten Sie dass %Pd = (Polyzerstreubarkeits-Index) ½ x 100.

Dynamische Lichtstreuung und Kristallisations-Screening

Wie in Abbildung 4 gezeigt, kann DLS verwendet werden, um 2 aus den 3 Lösungszuständen heraus mit filter zu versehen, die unwahrscheinlich, zu Kristallwachstum der hohen Qualität zu führen sind, prüft d.h. mit großen Verunreinigungen und Proben mit A <2 -8,0 x 10 Mol-4 ml/G. Im Allgemeinen2 zwar, kann DLS Proben in Zone I, wo das Protein, Kristalle zu löslich ist zu produzieren, nicht von denen innerhalb Zone II (Kristallisationsschlitz) unterscheiden, wo die Bedingungen für Kristallgeneration der hohen Qualität optimal sind. Andererseits ist Kristallwachstum in sich selbst ein Anhäufungsprozeß, und als solches, prüfen Forscher im Allgemeinen die Grenze zwischen Zonen II und III, eher als die Grenze zwischen Zonen I und II. So, während DLS möglicherweise nicht die silbernen Kugelforscher hofften ist, dass es sein würde, erfüllt sie noch eine wichtige Rolle in seiner Fähigkeit, Proben heraus mit filter zu versehen, die unwahrscheinlich sind, Kristalle der hohen Qualität zu produzieren.

Endo-Pg I Mit Filter Versehend

Eine geläufige Vorrichtung für die Unterbrechung von Pflanzenzellen durch pathogene microbials ist der enzymatische Abbau des Pektins in der Zellwand durch Endo-Pg I, eine glykosylierte Mikrobenhydrolase. In den neuen Studien waren Kato et al. in der Lage, die Kristallstrukturen von drei Formularen Endo-Pg I von Stereum-purpureum zu lösen - Endo-Pg Ia, mit zwei Zuckerketten, Endo-Pg IS, mit vier Zuckerketten und De-Endo-Pg Ia, das de-glykosylierte Formular des Endos-Pg Ia. Die Forscher waren nicht imstande, ein viertes Formular des Enzyms, Endo-Pg Ib zu kristallisieren, mit drei Zuckerketten pro Protein und berichteter Schwierigkeit, wenn sie Qualitätskristalle für das Formular des Endos-Pg IS des Enzyms erreichten.

Dynamische Lichtstreuung und Endo-Pg I Mit Filter Versehend

Der Vorkristall studiert für die umfaßte DLS Kennzeichnung des Endos-Pg I Projekt unter verdünnten Bedingungen. Die DLS-Ergebnisse für die Studie werden in Abbildung 5 gezeigt, die Polyzerstreubarkeitswerte von 7,4%, von 14,9% und von 21,2% für die drei Proteinformulare anzeigt, in denen Kristalle und 29,1% für das Formular erreicht wurden, das Kristalle produzieren nicht konnte. Diese Ergebnisse sind mit dem ~20% PD-ungefähren Richtwert für DLS-Kristallscreening in Einklang.

Abbildung 5. DLS-Ergebnisse (PD = Polyzerstreubarkeit) von der Vorkristall Kennzeichnung der vier Formulare Endos-Pg I und der Kristallfotos. erreicht und 29,1% für das Formular, das Kristalle produzieren nicht konnte. Diese Ergebnisse sind mit dem ~20% PD-ungefähren Richtwert für DLS-Kristallscreening in Einklang.

Nano-Anlage Zetasizer

Die Nano-Anlage Zetasizer von Malvern-Instrumenten ist das erste Kreditpapier der Privatwirtschaft, zum der Kleinteile und der Software für kombinierte dynamische, statische und elektrophoretische Lichtstreuungsmaße zu umfassen. Die große Auswahl von den Beispieleigenschaften, die für Maß mit der Nano-Anlage Zetasizer erhältlich sind, umfassen, Teilchengröße, Molekulargewicht und Zetapotential.

Die Nano-Anlage Zetasizer wurde speziell konstruiert, um die niedrige Konzentration und die Probenmengenbedingungen zu erfüllen, die gewöhnlich mit den pharmazeutischen und biomolekularen Anwendungen, zusammen mit den Anforderungen der hohen Konzentration für kolloidale Anwendungen verbunden sind. Diese eindeutige Mischung von Anforderungen Zufriedenzustellen war über die Integration einer optischen Rückstreuanlage und der Auslegung einer neuen Zellkammer erreicht. Als Folge dieser Merkmale überschreiten die Nano-Bedingungen Zetasizer für Stichprobengröße und die Konzentration weit die für jedes andere handelsübliche dynamische Lichtstreuungsinstrument.

Abbildung 6. Nano-Anlage Malvern-Instrumente Zetasizer.

Anmerkung: Ein ganzer Satz Bezüge kann erhalten werden, indem man das Originaldokument anspricht.

Quelle: „Dynamische Lichtstreuung - die Silberne Kugel Für Protein-KristallScreening? “, Anwendungs-Anmerkung durch Malvern-Instrumente.

Zu mehr Information über diese Quelle besuchen Sie bitte Malvern Instruments Ltd (GROSSBRITANNIEN) oder Malvern-Instrumente (USA).

Date Added: May 13, 2005 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 01:25

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit