Investigación de la Cristalización de la Proteína Usando la Dispersión Luminosa Dinámica Usando el Equipo de los Instrumentos de Malvern

Temas Revestidos

Antecedentes
     Incremento de los Cristales de la Proteína
     El Segundo Coeficiente de Virial
     Medición del Segundo Coeficiente de Virial
     El Segundo Coeficiente de Virial y el Incremento Cristalino Óptimo
Determinación Asociada de los Problemas Del Segundo Coeficiente de Virial
     Dispersión Luminosa Dinámica
     Determinación Dinámica de la Dispersión Luminosa y de la Talla de Partícula
     Dispersión Luminosa y Agregación Dinámicas
Dispersión Luminosa e Investigación Dinámicas de la Cristalización
EndoPG I Que Revisa
     Dispersión Luminosa Dinámica y EndoPG I Que Revisa
Sistema Nano de Zetasizer

Antecedentes

En el principio de los 90, la dispersión luminosa dinámica (DLS) fue introducida como herramienta de la investigación para la cristalografía. Durante la última década DLS se ha validado extensamente en este papel, y los instrumentos dinámicos de la dispersión luminosa ahora se integran rutinario en laboratorios de la cristalografía de la Radiografía. Un error común sin embargo, es que DLS puede informar a uno qué muestras son probables rendir cristales. En la práctica, DLS se utiliza más apropiadamente como herramienta para revisar fuera las muestras que son poco probables rendir cristales. En este artículo, dirigimos la diferencia sutil en estas puntas, y examinamos el valor de las técnicas de la dispersión luminosa como herramientas cristalinas de la investigación.

Incremento de los Cristales de la Proteína

El tipo que determina el paso de progresión en la resolución de las estructuras cristalinas está determinando las condiciones óptimas para el incremento cristalino de alta calidad. Hay una multitud de reactivos para generar las “sopas” se crecen de qué cristales de alta calidad. Sin Embargo, todas las recetas tienden a ser específico de la proteína, y mientras que la modificación de una mezcla preferida para adaptarse a una nueva meta de la proteína es la aproximación estándar, a menudo, la suerte desempeña un papel importante en la generación de cristales de alta calidad de la proteína.

El Segundo Coeficiente de Virial

El segundo coeficiente virial (a)2 es una propiedad termodinámica que describe la fuerza de la acción recíproca entre la proteína y el disolvente. Para los sistemas del proteína-disolvente con A2 > 0, la proteína “tiene gusto del disolvente” más que sí mismo y tiende a ser soluble. Cuando A2 = 0, el disolvente se describe como disolvente de la theta, indicando que la fuerza de la acción recíproca del partícula-disolvente es equivalente a la fuerza de la acción recíproca de la partícula-partícula. Cuando A2 << 0, la proteína “se tiene gusto” mucho más que el disolvente, y tiende a agregar en el precipitado amorfo. Cuando A2 es apenas ligeramente negativa sin embargo, las condiciones son ideales para el incremento cristalino de la proteína en la saturación de las concentraciones (Cuadro 1).

Cuadro 1. índice de éxito del incremento Cristalino en función del 2do coeficiente virial (a)2.

Medición del Segundo Coeficiente de Virial

El 2do coeficiente virial se mide típicamente usando técnicas estáticas de la dispersión (SLS) luminosa. La expresión de Rayleigh usada para describir dispersar de la luz de las partículas más pequeñas que la longitud de onda de la luz de incidente se da en la Ecuación 1, donde está un constante K óptico, C es la concentración de la partícula, M es el peso molecular de promedio de peso, A2 es el 2do coeficiente virial, y Rè es la relación de transformación de Rayleigh de dispersado a la intensidad de luz de incidente.

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Como evidente en la Ecuación 1, KC/Rè debe ser lineal con la concentración, con una interceptación igual hasta el 1/M y un declive que sea proporcional al A.2

El Segundo Coeficiente de Virial y el Incremento Cristalino Óptimo

El uso del 2do coeficiente virial como parámetro de la investigación para las condiciones óptimas del incremento cristalino era primero sugiere por Wilson y otros, que definió la ventana de la cristalización como -0,8 x 10-4 > A2 > -8,0 x 10-4 (mol de ml/g)2. Esta muesca de la ventana o del cristal de la cristalización se destaca como zona II en el Cuadro 2, que muestra los resultados estáticos de la dispersión luminosa para la lisozima en diversas concentraciones de la sal en el almacenador intermediaro del ácido acético (pH 4).

Cuadro 2. gráficos de Debye para la lisozima en diversas concentraciones del NaCl en almacenador intermediaro del ácido acético en pH 4. El destacar gris en la zona II, define la muesca de la cristalización, donde -0,8 x 10-4 > A2 > -8,0 x 10.-4

Determinación Asociada de los Problemas Del Segundo Coeficiente de Virial

Mientras Que los crystallographers han disfrutado de éxito usando la ventana de la cristalización para establecer condiciones de la solución óptima, el número de mediciones, y por lo tanto el tiempo requerido (hacia arriba de 2 horas), evaluar A2 para un único disolvente puede ser problemática, determinado para ésas que buscan una alta aproximación de la producción a la investigación cristalina de la proteína.

Dispersión Luminosa Dinámica

DLS es una técnica que es complementaria a la dispersión luminosa estática, y se puede realizar en escala de tiempo medida en minutos bastante que horas. En DLS, dispersando intensidad las fluctuaciones se vigilan a través escala de tiempo de los µs y después se correlacionan. Las fluctuaciones de la intensidad son una consecuencia del movimiento de la partícula, y la propiedad medida en el análisis de correlación es la distribución de los coeficientes de difusión. La talla entonces se calcula usando la ecuación de Alimentar-Einstein (Eq. 2), donde está el radio el DERECHO hidrodinámico, k es el constante de Boltzmann, T es la temperatura, el ç es la viscosidad solvente y D es el coeficiente de difusión.

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Dynamic Light Scattering and Particle Size Determination

Figure 3 shows a representative particle size distribution determined using DLS. Since the scattering intensity is ~ proportional to the particle molecular weight, DLS is very sensitive to aggregation and large impurities, even at low concentrations.

Figure 3. Representative DLS intensity particle size distribution.

As such, the technique is ideally suited for distinguishing samples that are unlikely to yield high quality crystals, due to the presence of impurities or non-specific aggregates, i.e. solutions residing in zone III of a Debye plot (Figure 2) where A2 << 0.

Dynamic Light Scattering and Aggregation

Figure 4 shows a comparison of the types of aggregation observed at both high and low concentration for typical protein samples, along with typical size distributions measured using DLS. The rule of thumb target for crystal screening using DLS is ~20% polydispersity (Pd), i.e. if the Pd < ~20% the sample is considered to be an ideal single population with no aggregates present. If the Pd > 20% on the other hand, the presence of non-specific aggregates, various oligiomeric states, and/or impurities decreases the likelihood of high quality crystal generation.

Figure 4. Schematic showing the types of aggregation observed at low and high concentration for typical protein samples. The A2 las zonas son ésas detalladas en los gráficos de Debye mostrados en el Cuadro 2, y las distribuciones dimensionales son representante de ésos medidos para cada zona en las concentraciones diluídas usadas para las mediciones estáticas y dinámicas de la dispersión luminosa. Observe que %Pd = (el ½ x 100 del Índice de la Polidispersidad).

Dispersión Luminosa e Investigación Dinámicas de la Cristalización

Tal y como se muestra en del Cuadro 4, DLS se puede utilizar para revisar 2 fuera de las 3 condiciones de la solución que son poco probables de llevar al incremento cristalino de alta calidad, es decir muestrea con las impurezas y las muestras grandes con A <2 -8,0 x 10 mol-4 de ml/G. En2 general sin embargo, DLS no puede distinguir muestras en la zona I, donde está demasiado soluble la proteína producir cristales, de ésas dentro de la zona II (muesca de la cristalización), donde están óptimas las condiciones para la generación cristalina de alta calidad. Por otra parte, el incremento cristalino es intrínsecamente un proceso de la agregación, y como tal, los investigadores están sondando generalmente el límite entre las zonas II e III, bastante que el límite entre las zonas I e II. Tan mientras que DLS puede no ser los investigadores de plata del punto negro esperaba que sería, todavía satisface un papel importante en su capacidad de revisar fuera las muestras que son poco probables producir los cristales de alta calidad.

EndoPG I Que Revisa

Un mecanismo común para la desorganización de las células de la instalación por microbials patógenos es la degradación enzimática de la pectina en la pared celular al lado del EndoPG I, una hidrolasa microbiana glycosylated. En estudios recientes, Kato y otros podía resolver las estructuras cristalinas de tres formularios del EndoPG I del purpureum de Stereum - EndoPG Ia, con dos encadenamientos del azúcar, EndoPG Ic, con cuatro encadenamientos del azúcar, y el De-EndoPG Ia, el formulario de-glycosylated del EndoPG Ia. Los investigadores no podían cristalizar un cuarto formulario de la enzima, EndoPG Ib, con tres encadenamientos del azúcar por la proteína, y dificultad señalada en la obtención de los cristales de la calidad para el formulario del Ic del EndoPG de la enzima.

Dispersión Luminosa Dinámica y EndoPG I Que Revisa

El pre-cristal estudia para la caracterización incluida proyecto del EndoPG I DLS bajo condiciones diluídas. Los resultados de DLS para el estudio se muestran en el Cuadro 5, que indica valores de la polidispersidad de 7,4%, 14,9%, y 21,2% para los tres formularios de la proteína donde los cristales fueron obtenidos y 29,1% para el formulario que no pudo producir cristales. Estos resultados son constantes con la regla empírica del Paladio del ~20% para la investigación cristalina de DLS.

Cuadro 5. resultados de DLS (Paladio = polidispersidad) de la caracterización del pre-cristal de los cuatro formularios del EndoPG I y de las fotos cristalinas. obtenido y 29,1% para el formulario que no pudo producir cristales. Estos resultados son constantes con la regla empírica del Paladio del ~20% para la investigación cristalina de DLS.

Sistema Nano de Zetasizer

El sistema Nano de Zetasizer de los Instrumentos de Malvern es el primer instrumento comercial para incluir el soporte físico y el software para las mediciones dinámicas, estáticas, y electroforéticas combinadas de la dispersión luminosa. La amplia gama de las propiedades de la muestra disponibles para la medición con el sistema Nano de Zetasizer incluye, talla de partícula, peso molecular, y potencial de la zeta.

El sistema Nano de Zetasizer fue diseñado específicamente para cumplir los requisitos inferiores del volumen de la concentración y de muestra asociados típicamente a aplicaciones farmacéuticas y biomoleculares, junto con los requisitos de la alta concentración para las aplicaciones coloidales. La Satisfacción de esta mezcla única de requisitos era realizada vía la integración de un sistema óptico del retrodifusor y del diseño de un compartimiento nuevo de la célula. Como consecuencia de estas características, los pliegos de condiciones Nanos de Zetasizer para el tamaño de muestra y la concentración exceden lejos ésos para cualquier otro instrumento dinámico disponible en el comercio de la dispersión luminosa.

Cuadro 6. sistema Nano de Zetasizer de los Instrumentos de Malvern.

Nota: Un conjunto completo de referencias puede ser obtenido refiriendo al documento de fuente.

Fuente: ¿“Dispersión Luminosa Dinámica - el Punto Negro De Plata Para la Investigación Cristalina de la Proteína? ”, Nota de Aplicación por los Instrumentos de Malvern.

Para más información sobre esta fuente visite por favor Malvern Instruments Ltd (REINO UNIDO) o los Instrumentos de Malvern (los E.E.U.U.).

Date Added: May 13, 2005 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 01:48

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