जिन विषय
पृष्ठभूमि
प्रोटीन क्रिस्टल की वृद्धि
दूसरा virial गुणांक
दूसरा virial गुणांक के मापन
दूसरा virial गुणांक और इष्टतम क्रिस्टल ग्रोथ
दूसरा virial गुणांक की समस्याएँ एसोसिएटेड निर्धारण
गतिशील लाइट छितराया
गतिशील लाइट छितराया और कण आकार निर्धारण
गतिशील लाइट छितराया और एकत्रीकरण
गतिशील लाइट छितराया और Crystallisation स्क्रीनिंग
मैं स्क्रीनिंग EndoPG
गतिशील प्रकाश बिखरने और मैं स्क्रीनिंग EndoPG
Zetasizer नैनो सिस्टम
पृष्ठभूमि
1990 के दशक में, गतिशील प्रकाश बिखरने (DLS) क्रि के लिए एक प्रदर्शन उपकरण के रूप में पेश किया गया था. पिछले दशक के दौरान DLS इस भूमिका में व्यापक रूप से स्वीकार किए जाते हैं बन गया है, और गतिशील प्रकाश बिखरने उपकरणों अब नियमित एक्स - रे क्रि प्रयोगशालाओं में एकीकृत कर रहे हैं. लेकिन एक आम गलतफहमी यह है कि DLS एक बता सकते हैं जो नमूने क्रिस्टल उपज होने की संभावना है. अभ्यास में, DLS अधिक उचित बाहर नमूने है कि क्रिस्टल उपज की उम्मीद नहीं कर रहे हैं स्क्रीनिंग के लिए एक उपकरण के रूप में प्रयोग किया जाता है. इस अनुच्छेद में, हम इन बिंदुओं में सूक्ष्म अंतर का पता, और क्रिस्टल स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में प्रकाश बिखरने तकनीक के मूल्य की जांच.
प्रोटीन क्रिस्टल की वृद्धि
क्रिस्टल संरचनाओं के संकल्प में कदम निर्धारित दर उच्च गुणवत्ता क्रिस्टल विकास के लिए इष्टतम स्थितियों की पहचान है. "सूप" से जो उच्च गुणवत्ता क्रिस्टल बड़े हो रहे हैं पैदा करने के लिए अभिकर्मकों के एक भीड़ हैं. हालांकि, सभी व्यंजनों प्रोटीन विशिष्ट होते हैं, और जबकि एक पसंदीदा मिश्रण करने के लिए एक नए प्रोटीन लक्ष्य के अनुरूप संशोधित मानक दृष्टिकोण है, अधिक बार नहीं की तुलना में, उच्च गुणवत्ता वाले प्रोटीन क्रिस्टल की पीढ़ी में भाग्य एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है.
दूसरा virial गुणांक
दूसरा virial गुणांक (2 ए) एक thermodynamic प्रोटीन और विलायक के बीच बातचीत की शक्ति का वर्णन संपत्ति है. 2 एक> 0 के साथ प्रोटीन विलायक सिस्टम के लिए, प्रोटीन और खुद से "विलायक पसंद है" और घुलनशील हो जाता है. जब एक 2 = 0, विलायक थीटा विलायक के रूप में वर्णित है, दर्शाता है कि कण विलायक बातचीत शक्ति कण कण बातचीत की शक्ति के बराबर है. जब एक 2 <<0, प्रोटीन "ही पसंद है" बहुत विलायक से अधिक है, और अनाकार वेग में कुल के लिए जाता है. जब एक दो बस थोड़ा नकारात्मक है, लेकिन स्थिति saturating सांद्रता (चित्रा 1) पर प्रोटीन क्रिस्टल विकास के लिए आदर्श होते हैं .
चित्रा 1 2 virial गुणांक (2 ए) के एक समारोह के रूप में क्रिस्टल वृद्धि सफलता दर.
दूसरा virial गुणांक के मापन
2 virial गुणांक आम तौर पर स्थिर प्रकाश बिखरने तकनीक (SLS) का उपयोग करने के लिए मापा जाता है. रेले घटना प्रकाश की तरंग दैर्ध्य की तुलना में छोटे कणों से प्रकाश के बिखरने का वर्णन किया अभिव्यक्ति एक समीकरण है, जहां कश्मीर है एक निरंतर ऑप्टिकल, सी कण एकाग्रता है, एम वजन औसत आणविक भार है, एक 2 है में दिया जाता है 2 virial गुणांक है, और फिर घटना प्रकाश तीव्रता के लिए बिखरे हुए रेले अनुपात है.
(1)
के रूप में एक समीकरण में स्पष्ट के.सी. RE / एकाग्रता के साथ रैखिक एक 1 / एम और एक ढलान है कि 2 एक आनुपातिक है के बराबर अवरोधन के साथ होना चाहिए.
दूसरा virial गुणांक और इष्टतम क्रिस्टल ग्रोथ
इष्टतम विकास क्रिस्टल की स्थिति के लिए एक स्क्रीनिंग पैरामीटर के रूप में 2 virial गुणांक का उपयोग पहले विल्सन एट अल, जो -0.8 x 10 -4> 2 एक -8.0> x 10 -4 (mol एमएल crystallization खिड़की के रूप में परिभाषित द्वारा सुझाव था 2 / छ). चित्रा 2, जो एसिटिक एसिड बफर में विभिन्न नमक सांद्रता (4 पीएच) पर स्थिर प्रकाश lysozyme के लिए बिखरने के परिणाम से पता चलता है यह crystallization विंडो या क्रिस्टल स्लॉट क्षेत्र द्वितीय के रूप में प्रकाश डाला है.
चित्रा 2. 4 पीएच में एसिटिक एसिड बफर में विभिन्न NaCl सांद्रता में lysozyme Debye भूखंडों के लिए. ग्रे क्षेत्र द्वितीय में प्रकाश डाला, crystallization स्लॉट, जहां -0.8 x 10 -4> 2 ए> -8.0 x 10 -4 परिभाषित करता है.
दूसरा virial गुणांक की समस्याएँ एसोसिएटेड निर्धारण
जबकि crystallographers crystallization विंडो का उपयोग के लिए इष्टतम समाधान की स्थिति, माप की संख्या है, और इसलिए आवश्यक समय (2 घंटे के ऊपर) की स्थापना, एक उच्च मांग करने वालों के लिए विशेष रूप से एक एकल विलायक समस्याग्रस्त किया जा सकता के लिए 2 एक मूल्यांकन सफलता मिली है, throughput प्रोटीन क्रिस्टल स्क्रीनिंग के लिए दृष्टिकोण.
गतिशील लाइट छितराया
DLS एक तकनीक है कि स्थिर प्रकाश बिखरने के लिए पूरक है, और एक समय में घंटे के बजाय मिनट में मापा पैमाने पर किया जा सकता है है है. में DLS बिखरने तीव्रता उतार चढ़ाव μs समय तराजू भर में निगरानी कर रहे हैं और फिर सहसंबद्ध. तीव्रता उतार चढ़ाव कण की गति का एक परिणाम रहे हैं, और सहसंबंध विश्लेषण में मापा प्रसार गुणांक का वितरण संपत्ति है. आकार तो स्टोक्स आइंस्टीन (2 Eq.) समीकरण, जहां आरएच hydrodynamic त्रिज्या का उपयोग कर की गणना है, कश्मीर निरंतर बोल्ट्जमान, टी तापमान है, हॉट विलायक दलदलापन है और डी प्रसार गुणांक है.
(2)
गतिशील लाइट छितराया और कण आकार निर्धारण
चित्रा 3 एक प्रतिनिधि कण आकार का उपयोग करके निर्धारित वितरण से पता चलता है DLS. चूंकि बिखरने तीव्रता ~ कण आणविक वजन करने के लिए आनुपातिक है, DLS भी कम सांद्रता में बहुत एकत्रीकरण और बड़े दोष के प्रति संवेदनशील है .
चित्रा 3 प्रतिनिधि DLS तीव्रता कण आकार के वितरण.
जैसे, तकनीक आदर्श भेद नमूने है कि उच्च गुणवत्ता क्रिस्टल, दोष या गैर विशिष्ट समुच्चय की उपस्थिति के कारण, यानी एक Debye साजिश के क्षेत्र III में रहने समाधान (चित्रा 2) जहां A2 <<उपज की उम्मीद नहीं कर रहे हैं के लिए अनुकूल है 0.
गतिशील लाइट छितराया और एकत्रीकरण
चित्रा 4 विशिष्ट प्रोटीन के नमूने के लिए दोनों उच्च और कम एकाग्रता में मनाया एकत्रीकरण के प्रकार के एक विशिष्ट आकार का उपयोग करके मापा वितरण के साथ तुलना से पता चलता है DLS. क्रिस्टल का उपयोग स्क्रीनिंग के लिए अंगूठे लक्ष्य के शासन DLS है ~ 20% (पीडी) polydispersity, यानी अगर पीडी <~ 20% नमूने के लिए कोई वर्तमान समुच्चय के साथ एक आदर्श एकल जनसंख्या माना जाता है . यदि पी.डी.> दूसरे हाथ पर 20%, गैर विशिष्ट समुच्चय, विभिन्न oligiomeric राज्यों, और / या अशुद्धियों की उपस्थिति उच्च गुणवत्ता क्रिस्टल पीढ़ी की संभावना कम हो जाती है.
चित्रा 4 दिखा योजनाबद्ध एकत्रीकरण के प्रकार विशिष्ट प्रोटीन के नमूने के लिए कम और उच्च एकाग्रता में मनाया . एक दो क्षेत्रों Debye चित्रा 2 में दिखाया गया भूखंडों में विस्तृत उन रहे हैं, और आकार वितरण पतला सांद्रता में स्थिर और गतिशील प्रकाश बिखरने माप के लिए इस्तेमाल किया प्रत्येक क्षेत्र के लिए मापा उन के प्रतिनिधि हैं. ध्यान दें कि% पी.डी. = (Polydispersity इंडेक्स) साढ़े x 100.
गतिशील लाइट छितराया और Crystallisation स्क्रीनिंग
चित्रा 4 में दिखाया गया है , DLS 2 3 समाधान शर्तों के लिए उच्च गुणवत्ता क्रिस्टल विकास, बड़े और दोष के नमूनों के साथ एक 2 -8.0 <x 10 -4 mol एमएल के साथ यानी नमूने / करने के लिए नेतृत्व की संभावना नहीं के बाहर स्क्रीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है 2 जी. सामान्य हालांकि, DLS नमूने क्षेत्र, मैं जहां भी क्रिस्टल, उत्पादन क्षेत्र द्वितीय के भीतर उन (crystallization स्लॉट), जहां शर्तों उच्च गुणवत्ता क्रिस्टल पीढ़ी के लिए इष्टतम से घुलनशील प्रोटीन है में भेद नहीं कर सकते हैं. दूसरी ओर, क्रिस्टल विकास स्वाभाविक एकत्रीकरण की प्रक्रिया है, और जैसे, शोधकर्ताओं आम तौर पर जोनों द्वितीय और तृतीय के बीच की सीमा की जांच कर रहे हैं क्षेत्रों के बीच सीमा के बजाय, मैं और द्वितीय. तो, जबकि DLS नहीं किया जा सकता है कि चांदी की गोली शोधकर्ताओं को उम्मीद कर रहे थे यह होगा, यह अभी भी अपने नमूने है कि उच्च गुणवत्ता क्रिस्टल का उत्पादन करने की संभावना नहीं हैं स्क्रीन की क्षमता में एक महत्वपूर्ण भूमिका पूरा.
मैं स्क्रीनिंग EndoPG
रोगजनक microbials के द्वारा संयंत्र कोशिकाओं के विघटन के लिए एक आम तंत्र मैं, एक ग्लाइकोसिलेटेड माइक्रोबियल hydrolase EndoPG द्वारा कोशिका दीवार में पेक्टिन के enzymatic गिरावट है. हाल के अध्ययन में, Kato एट अल. मैं Stereum purpureum से EndoPG के तीन रूपों के क्रिस्टल संरचनाओं को हल करने में सक्षम थे - EndoPG आइए , दो चीनी चेन, आईसी चार चीनी श्रृंखला के साथ, EndoPG, और के साथ De-EndoPG आइए , De-ग्लाइकोसिलेटेड के रूप EndoPG आइए. शोधकर्ताओं ने प्रोटीन के अनुसार तीन चीनी जंजीरों से एंजाइम की चौथी फार्म, EndoPG आईबी, मणिभ बनाना करने में असमर्थ थे, और EndoPG आईसी फार्म एंजाइम की गुणवत्ता के लिए क्रिस्टल प्राप्त करने में कठिनाई की सूचना दी.
गतिशील प्रकाश बिखरने और मैं स्क्रीनिंग EndoPG
EndoPG के लिए पूर्व क्रिस्टल अध्ययन मैं शामिल परियोजना DLS पतला शर्तों के तहत लक्षण वर्णन. DLS अध्ययन के लिए परिणाम चित्रा 5 है, जो 7.4%, 14.9%, और तीन प्रोटीन रूपों जहां क्रिस्टल प्राप्त किया गया और फार्म का है कि क्रिस्टल का उत्पादन करने में विफल रहा है के लिए 29.1% के लिए 21.2% की polydispersity मान इंगित करता है में दिखाया जाता है. ये परिणाम ~ 20% अंगूठे के लिए पी.डी. नियम के साथ संगत कर रहे हैं DLS क्रिस्टल स्क्रीनिंग.
चित्रा 5 मैं और क्रिस्टल तस्वीरों EndoPG की चार रूपों के पूर्व क्रिस्टल लक्षण वर्णन से DLS परिणाम (पीडी = polydispersity).. प्राप्त है और फार्म का है कि क्रिस्टल का उत्पादन करने में विफल रहा है के लिए 29.1%. ये परिणाम ~ 20% DLS क्रिस्टल स्क्रीनिंग के लिए पी.डी. अंगूठे का नियम के साथ संगत कर रहे हैं.
Zetasizer नैनो सिस्टम
Zetasizer नैनो Malvern उपकरण सिस्टम पहली व्यावसायिक साधन और संयुक्त गतिशील, स्थिर और electrophoretic प्रकाश बिखरने माप के लिए हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर शामिल है. नमूना के साथ माप के लिए उपलब्ध गुणों की एक विस्तृत रेंज Zetasizer नैनो प्रणाली में शामिल हैं, कण आकार, आणविक भार है, और संभावित जीटा .
Zetasizer नैनो प्रणाली विशेष रूप से कोलाइडयन अनुप्रयोगों के लिए उच्च एकाग्रता की आवश्यकताओं के साथ साथ आमतौर पर दवा और biomolecular अनुप्रयोगों के साथ जुड़े कम एकाग्रता और नमूना मात्रा आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए डिजाइन किया गया था. आवश्यकताओं के इस अनूठे मिश्रण संतोषजनक एक backscatter ऑप्टिकल प्रणाली के एकीकरण और एक उपन्यास सेल चैम्बर के डिजाइन के माध्यम से पूरा किया गया. इन सुविधाओं में से एक परिणाम के रूप में, Zetasizer नैनो नमूना आकार और एकाग्रता के लिए विनिर्देशों तक किसी भी अन्य वाणिज्यिक उपलब्ध गतिशील प्रकाश बिखरने साधन के लिए उन से अधिक है.
चित्रा 6 Malvern उपकरण नैनो Zetasizer प्रणाली.
नोट: संदर्भ का एक पूरा सेट स्रोत दस्तावेज़ की चर्चा करते हुए प्राप्त किया जा सकता है .
स्रोत: "गतिशील लाइट छितराया - रजत बुलेट प्रोटीन क्रिस्टल स्क्रीनिंग के लिए?", Malvern उपकरण द्वारा आवेदन नोट.
इस स्रोत के बारे में अधिक जानकारी के लिए कृपया देखें Malvern उपकरण (यूके ) लिमिटेड या Malvern उपकरण ( यूएसए ).