Malvern 계기에서 장비를 사용하여 동적인 가벼운 뿌리기 를 사용하는 가리기 단백질 결정화

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배경
     단백질 결정의 성장
     Virial 두번째 계수
     Virial 두번째 계수의 측정
     Virial 두번째 계수 및 최적 결정 성장
Virial 두번째 계수의 문제 관련되는 결심
     동적인 가벼운 뿌리기
     동적인 가벼운 뿌리 및 입자 크기 결심
     동적인 가벼운 뿌리고는 및 집단
동적인 가벼운 뿌리고는 및 결정화 검열
가리는 EndoPG I
     가리는 동적인 가벼운 뿌리고는 및 EndoPG I
Zetasizer Nano 시스템

배경

1990년대 초에, 동적인 가벼운 뿌리는 것은 (DLS) 결정학을 위한 검열 공구로 소개되었습니다. 지난 십년간 DLS는 이 역할에서 넓게 받아들여 되고, 동적인 가벼운 뿌리 계기는 지금 엑스레이 결정학 실험실로 일상적으로 통합됩니다. 그러나 일반 오해는, 결정을 열매를 산출하기 위하여 어느 견본이 확률이 높은 지 DLS가 하나에게 말할 수 있다 입니다. 실제로, DLS는 결정을 열매를 산출하게 확률이 낮은 견본을 가려내기를 위한 공구로 더 적합하게 사용됩니다. 이 약품에서는, 우리는 이 점에 있는 미묘한 다름을 제시하고, 수정같은 검열 공구로 가벼운 뿌리 기술의 가치를 검토합니다.

단백질 결정의 성장

결정 구조의 해결책에 있는 단계를 결정하는 비율은 고품질 결정 성장을 위한 최적 조건을 확인하고 있습니다. 어느 고품질 결정이 생성 증가되는지 를 위한 시약의 군중이에서 "수프" 있습니다. 그러나, 모든 조리법은 단백질 특정적이어 경향이 있고, 마음에 드는 혼합을 새로운 단백질 표적을 적응시키는 위하여 변경하는 것이 표준 접근의, 종종 동안, 운은 고품질 단백질 결정의 발생에 있는 중요한 역할을 합니다.

Virial 두번째 계수

두번째 virial 계수 (a)는2 단백질과 용매 사이 상호 작용 병력을 기술하는 열역학적 성질입니다. 단백질 용매 시스템을 위해를 가진 A는2 > 0, 단백질 "용매" 좀더 보다는 자체를 좋아하고 녹아 경향이 있습니다. A가2 시타 용매로 = 0, 용매 기술될 때, 입자 용매 상호 작용 병력이 입자 입자 상호 작용 병력과 동등하다는 것을 표시하는. A가 <<2 0, 단백질 "" 매우 좀더 보다는 좋아할 때 용매는, 무조직 침전물로 모여 경향이 있습니다. A가 다만2 경미하게 부정의 그러나 때, 조건은 사격량 (숫자 1)를 포화시키기에 단백질 결정 성장에 대하 이상적입니다.

제 2 virial 계수 (a)의 기능으로 숫자 1. 결정 성장 성공율2.

Virial 두번째 계수의 측정

제 2 virial 계수는 정체되는 가벼운 뿌리 기술을 사용하여 전형적으로 (SLS) 측정됩니다. 사건 빛의 파장 보다는 더 작은 입자에서 빛의 뿌리기 기술하기 위하여 이용된 Rayleigh 표정은 방정식 1에서 K가 광학적인 불변의 것인 곳에, C입니다 입자 사격량 주어집니다, M는 질량 평균 분자량입니다, A는2 제 2 virial 계수이고, Rè는 사건 가벼운 강렬에 뿌리는의 Rayleigh 비율입니다.

(1)

방정식 1에서 분명한 것과 같이, KC/Rè는 1/M와 A.에 비례적인 사면과 동등한 차단과 더불어 사격량에 선형, 이어야 합니다.2

Virial 두번째 계수 및 최적 결정 성장

최적 결정 성장 상태를 위한 검열 매개변수로 제 2 virial 계수의 사용은 -0.8 x 10로 결정화 Windows를 > A > -8.0 x 10 정의한 윌슨-4 에 의해 첫째로2 그 외 여러분 건의합니다 이었습니다,-4 (mL mol/g)2. 이 결정화 Windows 또는 결정 슬롯은 아세트산 버퍼 (PH 4)에 있는 다른 소금 농도에 라이소자임을 위한 정체되는 가벼운 뿌리 결과를 보여주는 숫자 2에서 지역 II로 강조됩니다.

PH 4.에 아세트산 버퍼에 있는 다른 NaCl 농도에 라이소자임을 위한 숫자 2. Debye 작의. 지역 II에서 회색 강조가, 결정화 슬롯을, -0.8 x 10 >-4 A >2 -8.0 x 10. 정의하는.-4

Virial 두번째 계수의 문제 관련되는 결심

측정의 최적 솔루션 조건, 수, 및 그러므로 2 시간의 (위쪽으로) 요구되는 시간을 설치하는 위하여 crystallographers가 결정화 Windows를 사용하여 성공을 즐기는 동안, 단 하나2 용매를 위한 A를 평가하는 것은 높은 처리량 접근을 찾는 그들을 위해 문제적, 단백질 수정같은 검열에 특히일 수 있습니다.

동적인 가벼운 뿌리기

DLS는 정체되는 가벼운 뿌리기에 무료한 기술이고, 시간의 척도에 분에서 측정된 시간 보다는 오히려 능력을 발휘할 수 있습니다. 강렬을 뿌리는 DLS에서는 동요는 µs 시간의 척도를 통해 감시되고 그 후에 상관됩니다. 강렬 동요는 입자 움직임의 결과이고, 상호 관계 분석에 있는 측정한 속성은 유포 계수의 배급입니다. 규모는 불을 때 아인슈타인 방정식 (Eq를 사용하여 그 때 산출됩니다. 2)는, RH가 유체역학 반경인 곳에, k 볼츠맨 불변의 것입니다, T는 온도입니다, ç는 용해력이 있는 점성이고 D는 유포 계수입니다.

(2)

Dynamic Light Scattering and Particle Size Determination

Figure 3 shows a representative particle size distribution determined using DLS. Since the scattering intensity is ~ proportional to the particle molecular weight, DLS is very sensitive to aggregation and large impurities, even at low concentrations.

Figure 3. Representative DLS intensity particle size distribution.

As such, the technique is ideally suited for distinguishing samples that are unlikely to yield high quality crystals, due to the presence of impurities or non-specific aggregates, i.e. solutions residing in zone III of a Debye plot (Figure 2) where A2 << 0.

Dynamic Light Scattering and Aggregation

Figure 4 shows a comparison of the types of aggregation observed at both high and low concentration for typical protein samples, along with typical size distributions measured using DLS. The rule of thumb target for crystal screening using DLS is ~20% polydispersity (Pd), i.e. if the Pd < ~20% the sample is considered to be an ideal single population with no aggregates present. If the Pd > 20% on the other hand, the presence of non-specific aggregates, various oligiomeric states, and/or impurities decreases the likelihood of high quality crystal generation.

Figure 4. Schematic showing the types of aggregation observed at low and high concentration for typical protein samples. The A2 지역은 숫자 2에서 보인 Debye 작의에서 선발된 그들이고, 크기 분포는 정체되는 동적인 가벼운 뿌리 측정에 사용된 묽게 한 사격량에 각 지역을 위해 측정된 그들의 담당자입니다. %Pd = (Polydispersity 색인) ½ x 100 유의하십시오.

동적인 가벼운 뿌리고기 및 결정화 검열

숫자 4에서 보이는 것처럼, DLS는 큰 불순 그리고 견본으로, i.e 간색합니다를 가진 A < mL -8.0 x 10 mol/G. 고품질 결정 성장에 지도하기 확률이 낮은 3개의2 해결책 조건에서 2장의-4 가리기 위하여 이용될 수 있습니다. 그러나2 장군에서는, DLS는 지역 II (결정화 슬롯) 내의 그들과 조건이 고품질 수정같은 발생을 위해 최적 인 곳에, 결정을 생성하기 에는 단백질이 너무 녹는 지 곳에 지역 I에 있는 견본을 구별할 수 없습니다. 다른 한편으로는, 결정 성장은 지역 사이에서 경계 보다는 오히려 지역 사이에서 본래부터 그것 자체 집단 프로세스, 연구원 일반적으로 시험하고 있습니다 경계를 II와 III, I와 II.입니다. 따라서 DLS는 희망하고 있었는 은 탄알 연구원이지 않는지도 모르는 그러나 일 것이라는 점을, 그것은 아직도 고품질 결정을 생성하게 확률이 낮은 견본을 가려내는 그것의 기능에 있는 중요한 역할을 성취합니다.

가리기 EndoPG I

병원성 microbials에 의하여 공장 세포의 중단을 위한 일반적인 기계장치는 EndoPG I 의 glycosylated 미생물 가수분해 효소 옆에 세포벽에 있는 펙틴의 효소 강직입니다. 최근 연구 결과에서는, Kato는 그 외 여러분 Stereum purpureum - EndoPG Ia에서 EndoPG I의 3개의 양식의 결정 구조를, 4개의 설탕 사슬 및 De EndoPG Ia 의 EndoPG Ia의 de glycosylated 양식과 더불어 2개의 설탕 사슬 , EndoPG IC와 더불어, 해결할 수 있었습니다 . 연구원은 효소, 단백질 당 3개의 설탕 사슬, 및 효소의 EndoPG IC 양식을 위한 질 결정 장악에 있는 보고한 어려움과 더불어 EndoPG Ib의 제 4 양식을, 결정할 수 없습니다.

가리기 동적인 가벼운 뿌리고기 및 EndoPG I

전 결정은 묽게 한 조건 하에서 EndoPG I 계획사업에 의하여 포함된 DLS 특성을 위해 공부합니다. 연구 결과를 위한 DLS 결과는 결정이 및 결정을 생성하지 못한 양식을 위해 29.1% 장악된 3개의 단백질 양식을 위해 7.4%, 14.9%, 및 21.2% polydispersity 값을 표시하는 숫자 5에서 보입니다. 이 결과는 DLS 수정같은 검열을 위한 ~20% Pd 어림짐작으로 일관됩니다.

EndoPG I와 수정같은 사진의 4개의 양식의 전 결정 특성에서 숫자 5. DLS 결과 (Pd = polydispersity). 장악하는과 결정을 생성하지 못한 양식을 위해 29.1%. 이 결과는 DLS 수정같은 검열을 위한 ~20% Pd 어림짐작으로 일관됩니다.

Zetasizer Nano 시스템

Malvern 계기에서 Zetasizer Nano 시스템은 결합한 동 적이고, 정체되는, 및 전기 이동 가벼운 뿌리 측정을 위한 하드웨어 그리고 소프트웨어를 포함하는 첫번째 상업 계기 입니다. Zetasizer Nano 시스템을 가진 측정을 위해 유효한 견본 속성의 광범위는, 입자 크기, 분자량 및 zeta 잠재력 포함합니다.

Zetasizer Nano 시스템은 특히 전형적으로 콜로이드 응용을 위한 높은 농도 필수품과 더불어 약제와 생체 고분자 응용과, 관련되었던 낮은 사격량과 견본 양 요구에 응하기 위하여 디자인되었습니다. 필수품의 이 유일한 혼합을 만족시키는 것은 비발한 세포 약실의 후방산란 광학계 그리고 디자인의 통합을 통해 달성되었습니다. 이 특징 때문에, 견본 크기를 위한 Zetasizer Nano 논고 및 사격량은 멀리 다른 어떤 상업적으로 이용 가능한 동적인 가벼운 뿌리 계기를 위해 그들을 초과합니다.

숫자 6. Malvern 계기 Zetasizer Nano 시스템.

주: 참고의 완전한 세트는 원시 문서를 나타나서 장악될 수 있습니다.

근원: "동적인 가벼운 뿌리기 - 단백질 수정같은 검열을 위한 은 탄알? ", Malvern 계기에 의하여 응용 주.

이 근원에 추가 정보를 위해 Malvern 계기 주식 회사 (UK) 또는 Malvern 계기 (미국)를 방문하십시오.

Date Added: May 13, 2005 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 01:33

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