Het Eiwit Onderzoek van de Kristallisatie Door Dynamische het Lichte Verspreiden zich Gebruikende Apparatuur Van Instrumenten Te Gebruiken Malvern

Besproken Onderwerpen

Achtergrond
     De Groei van EiwitKristallen
     De Tweede Coëfficiënt Virial
     Meting van de Tweede Coëfficiënt Virial
     De Tweede Coëfficiënt Virial en de Optimale Groei van het Kristal
Problemen Bijbehorende Bepaling van de Tweede Coëfficiënt Virial
     Het Dynamische Lichte Verspreiden zich
     Dynamische het Lichte Verspreiden zich en van de Grootte van het Deeltje Bepaling
     Het Dynamische Lichte Verspreiden zich en Samenvoeging
Het het Dynamische Lichte Verspreiden zich en Onderzoek van de Kristallisatie
EndoPG I die Onderzoekt
     Het Dynamische Lichte Verspreiden zich en EndoPG I die Onderzoeken
Nano Systeem van Zetasizer

Achtergrond

In de vroege jaren '90, het dynamische lichte werd verspreiden zich (DLS) geïntroduceerd als onderzoekshulpmiddel voor kristallografie. Tijdens het afgelopen decennium is DLS wijd toegelaten in deze rol geworden, en de dynamische het lichte verspreiden zich instrumenten zijn uit routine nu geïntegreerd in de kristallografielaboratoria van de Röntgenstraal. Een gemeenschappelijke misvatting nochtans, is dat DLS kan vertellen die de steekproeven waarschijnlijk zullen kristallen opbrengen. In de praktijk, wordt DLS geschikter gebruikt als hulpmiddel om steekproeven uit te onderzoeken die kristallen waarschijnlijk niet kunnen opbrengen. In dit artikel, richten wij het subtiele verschil in deze punten, en onderzoeken de waarde van het lichte verspreiden zich technieken als hulpmiddelen van het kristalonderzoek.

De Groei van EiwitKristallen

De tarief bepalende stap in de resolutie van kristalstructuren identificeert de optimale voorwaarden voor hoogte - de groei van het kwaliteitskristal. Er is een massa reagentia voor het produceren van de „soepen“ waarvan hoogte - de kwaliteitskristallen worden gekweekt. Nochtans, neigen alle recepten eiwit specifiek te zijn, en terwijl het wijzigen van een favoriete mengeling om een nieuw eiwitdoel aan te passen is de standaardbenadering, vaker wel dan niet, gelukspelen een significante rol in de generatie van hoogte - kwaliteits eiwitkristallen.

De Tweede Coëfficiënt Virial

De tweede virial coëfficiënt (a)2 is een thermodynamisch bezit beschrijvend de interactiesterkte tussen de proteïne en het oplosmiddel. Voor eiwit-oplosbare systemen met A2 > houden 0, de proteïne „van het oplosmiddel“ meer dan zelf en neigen oplosbaar te zijn. Wanneer A2 = 0, het oplosmiddel als thetaoplosmiddel worden beschreven, erop wijzend dat de deeltje-oplosbare interactiesterkte aan deeltje-deeltje interactiesterkte gelijkwaardig is. Wanneer A2 << 0, de proteïne „van zich veel meer“ dan het oplosmiddel, houdt en om in amorf precipitaat neigt bijeen te voegen. Wanneer A2 lichtjes nochtans enkel negatief is, zijn de voorwaarden ideaal voor de eiwitkristalgroei bij het verzadigen van concentraties (Figuur 1).

Figuur 1. Het tarief van het de groeisucces van het Kristal als functie van de 2de virial coëfficiënt (a)2.

Meting van de Tweede Coëfficiënt Virial

De 2de virial coëfficiënt wordt typisch gemeten gebruikend statische het lichte verspreiden zich (SLS) technieken. De uitdrukking Rayleigh wordt gebruikt wordt om het verspreiden van licht van deeltjes te beschrijven zich kleiner dan de golflengte van het inherente licht gegeven in Vergelijking 1, waar K een optische constante is, C is de deeltjesconcentratie, is M het gewichts gemiddelde moleculegewicht, is2 A de 2de virial coëfficiënt, en Rè is de verhouding Rayleigh van verspreide aan inherente lichtintensiteit die.

(1)

Zoals duidelijk in Vergelijking 1, zou KC/Rè met concentratie, met een onderschepping lineair moeten zijn gelijk aan 1/M en een helling die aan A. evenredig is.2

De Tweede Coëfficiënt Virial en de Optimale Groei van het Kristal

Het gebruik van de 2de virial coëfficiënt aangezien een onderzoeksparameter voor de optimale voorwaarden van de kristalgroei eerste was stelt door Wilson et al voor., die het kristallisatievenster als -0.8 x 10 >-4 A >2 -8.0 x 10 (-4 mol ml/g)2 definieerden. Deze van het kristallisatievenster of kristal groef wordt benadrukt als streek II in Figuur 2, die de statische het lichte verspreiden zich resultaten voor lypozyme bij verschillende zoute concentraties in azijnzuurbuffer (pH 4) toont.

Figuur 2. De percelen van Debye voor lypozyme bij de verschillende concentraties van NaCl in azijnzuurbuffer bij pH 4. Het grijs die in streek II benadrukken, bepaalt de kristallisatiegroef, waar -0.8 x 10-4 > A2 > -8.0 x 10-4.

Problemen Bijbehorende Bepaling van de Tweede Coëfficiënt Virial

Terwijl crystallographers van succes gebruikend het kristallisatievenster hebben genoten om optimale die oplossingsvoorwaarden duidelijk te maken, kan het aantal metingen, en vandaar de tijd (hoger dan 2 uren), wordt vereist om A2 voor één enkel oplosmiddel te evalueren problematisch, in het bijzonder voor die zijn die naar een hoge productiebenadering van eiwitkristalonderzoek streven.

Het Dynamische Lichte Verspreiden zich

DLS is een techniek die complementair is aan zich het statische lichte die verspreiden, en kan op tijdschaal worden uitgevoerd in notulen eerder dan uren wordt gemeten. In DLS, worden de verspreidende intensiteitsschommelingen gecontroleerd over µs tijdschalen en dan gecorreleerd. De intensiteitsschommelingen zijn een gevolg van deeltjesmotie, en het gemeten bezit in de correlatieanalyse is de distributie van verspreidingscoëfficiënten. De grootte wordt dan berekend gebruikend de vergelijking op:stoken-Einstein (Eq. 2), waar RELATIEVE VOCHTIGHEID de hydrodynamische straal is, is k de constante Boltzmann, is T de temperatuur, is ç de oplosbare viscositeit en D is de verspreidingscoëfficiënt.

(2)

Dynamic Light Scattering and Particle Size Determination

Figure 3 shows a representative particle size distribution determined using DLS. Since the scattering intensity is ~ proportional to the particle molecular weight, DLS is very sensitive to aggregation and large impurities, even at low concentrations.

Figure 3. Representative DLS intensity particle size distribution.

As such, the technique is ideally suited for distinguishing samples that are unlikely to yield high quality crystals, due to the presence of impurities or non-specific aggregates, i.e. solutions residing in zone III of a Debye plot (Figure 2) where A2 << 0.

Dynamic Light Scattering and Aggregation

Figure 4 shows a comparison of the types of aggregation observed at both high and low concentration for typical protein samples, along with typical size distributions measured using DLS. The rule of thumb target for crystal screening using DLS is ~20% polydispersity (Pd), i.e. if the Pd < ~20% the sample is considered to be an ideal single population with no aggregates present. If the Pd > 20% on the other hand, the presence of non-specific aggregates, various oligiomeric states, and/or impurities decreases the likelihood of high quality crystal generation.

Figure 4. Schematic showing the types of aggregation observed at low and high concentration for typical protein samples. The A2 de streken zijn die gedetailleerd die in de percelen Debye in Figuur 2 worden getoond, en de groottedistributies zijn representatief voor die gemeten voor elke streek bij de verdunde die concentraties voor statische en dynamische het lichte verspreiden zich metingen worden gebruikt. Neem nota van dat %Pd = (Polydispersity Index) ½ x 100.

Het het Dynamische Lichte Verspreiden zich en Onderzoek van de Kristallisatie

Zoals aangetoond in Figuur 4, kan DLS aan het scherm 2 uit de 3 oplossingsvoorwaarden worden gebruikt die tot hoogte waarschijnlijk niet kunnen leiden - de groei van het kwaliteitskristal, d.w.z. steekproeven met grote onzuiverheden en steekproeven met A <2 -8.0 x 10 mol-4 ml/g. In2 algemeen niettemin, kan DLS geen steekproeven in streek I, waar de proteïne te oplosbaar is om kristallen te produceren, van die binnen streek II (kristallisatiegroef) onderscheiden, waar de voorwaarden voor hoogte - de generatie van het kwaliteitskristal optimaal zijn. Anderzijds, is de kristalgroei inherent een samenvoegingsprocédé, en als dusdanig, sonderen de onderzoekers over het algemeen de grens tussen streken II en III, eerder dan de grens tussen streken I en II. Zo terwijl DLS niet kan zijn hoopten de zilveren kogelonderzoekers het zou zijn, vervult het uit nog een belangrijke rol in zijn capaciteit aan het schermsteekproeven die hoogte waarschijnlijk niet kunnen veroorzaken - kwaliteitskristallen.

EndoPG I die Onderzoeken

Een gemeenschappelijk mechanisme voor de verstoring van installatiecellen door pathogene microbials is de enzymatische degradatie van pectine in de celwand door EndoPG I, glycosylated microbiële hydrolase. In recente studies, Kato et al. konden de kristalstructuren van drie vormen van EndoPG I van purpureum oplossen Stereum - EndoPG Ia, met twee suikerkettingen, EndoPG Ic, met vier suikerkettingen, en DE-EndoPG Ia, de de-glycosylated vorm van EndoPG Ia. De onderzoekers konden een vierde vorm van het enzym, EndoPG Ib, met drie suikerkettingen per proteïne kristalliseren niet, en meldden moeilijkheid in het verkrijgen van kwaliteitskristallen voor de EndoPG Ic vorm van het enzym.

Het Dynamische Lichte Verspreiden zich en EndoPG I die Onderzoeken

De pre-kristalstudies voor EndoPG I project omvatten karakterisering DLS in de verdunde omstandigheden. De resultaten DLS voor de studie worden getoond in Figuur 5, die polydispersity op waarden van 7.4%, 14.9%, en 21.2% voor de drie eiwitvormen wijst waar de kristallen en 29.1% voor de vorm werden verkregen die er niet in slaagde om kristallen te produceren. Deze resultaten zijn verenigbaar met de ~20% Pd vuistregel voor DLS kristalonderzoek.

Figuur 5. DLS vloeit (Pd = polydispersity) uit de pre-kristalkarakterisering voort van de vier vormen van EndoPG I en kristalfoto's. verkregen en 29.1% voor de vorm die er niet in slaagde om kristallen te produceren. Deze resultaten zijn verenigbaar met de ~20% Pd vuistregel voor DLS kristalonderzoek.

Nano Systeem van Zetasizer

Het Nano systeem Zetasizer van Instrumenten Malvern is het eerste commerciële instrument om de hardware en de software voor gecombineerde dynamische, statische, en elektroforetische het lichte verspreiden zich metingen te omvatten. De brede waaier van steekproefeigenschappen beschikbaar voor meting met het Nano systeem Zetasizer omvat, deeltjesgrootte, moleculegewicht, en zeta potentieel.

Het Nano systeem Zetasizer werd specifiek ontworpen om aan de lage concentratie en steekproefvolumevereisten te voldoen typisch verbonden aan farmaceutische en biomoleculaire toepassingen, samen met de hoge concentratievereisten voor colloïdale toepassingen. Het Tevredenstellen van deze unieke mengeling van vereisten werd verwezenlijkt via de integratie van een backscatter optisch systeem en het ontwerp van een nieuwe celkamer. Ten gevolge van deze eigenschappen, overschrijden de Nano specificaties Zetasizer voor steekproefgrootte en concentratie ver die voor een ander in de handel verkrijgbaar dynamisch het lichte verspreiden zich instrument.

Figuur 6. Nano systeem van Zetasizer van de Instrumenten van Malvern.

Nota: Een volledige reeks verwijzingen kan worden verkregen door naar het brondocument te verwijzen.

Bron: „Het Dynamische Lichte Verspreiden zich - de Zilveren Kogel Voor het EiwitOnderzoek van het Kristal? “, De Nota van de Toepassing door Malvern Instruments.

Voor meer informatie over deze bron te bezoeken gelieve Instrumenten Malvern Instruments Ltd (het UK) of Malvern (de V.S.).

Date Added: May 13, 2005 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 01:19

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit