Кристаллизация Протеина Экранируя Путем Использование Динамический Светлый Разбрасывать Используя Оборудование От Аппаратур Malvern

Покрытые Темы

Предпосылка
     Рост Кристаллов Протеина
     Второй Коэффициент Virial
     Измерение Второго Коэффициента Virial
     Второй Коэффициент Virial и Оптимальное Выращивание Кристаллов
Определение Связанное Проблемами Второго Коэффициента Virial
     Динамический Светлый Разбрасывать
     Динамическое Светлый Определение Разбрасывать и Размера Частицы
     Динамические Светлый Разбрасывать и Комплексирование
Динамические Светлый Разбрасывать и Скрининг Кристаллизации
EndoPG I Экранируя
     Динамический Светлый Разбрасывать и EndoPG I Экранируя
Система Zetasizer Nano

Предпосылка

В начале 1990-ых годов, динамический светлый разбрасывать (DLS) было введен как инструмент скрининга для кристаллографии. Над прошлой декадой DLS было широко принятым в этой роли, и динамические аппаратуры светлый разбрасывать теперь по заведенному порядку интегрированы в лаборатории кристаллографии Рентгеновского Снимка. Общее неправильное представление однако, что DLS может сказать одному которые образцы правоподобны для того чтобы произвести кристаллы. На практике, DLS более соотвественно использовано как инструмент для экранировать вне образцы которые маловероятны для того чтобы произвести кристаллы. В настоящей статье, мы адресуем тонкую разницу в этих пунктах, и рассматриваем значение методов светлый разбрасывать как кристаллические инструменты скрининга.

Рост Кристаллов Протеина

Тариф определяя шаг в разрешение кристаллических структур определяет оптимальные условия для высокомарочного выращивания кристаллов. Множество реагентов для производить «супы» от которые высокомарочные кристаллы растутся. Однако, все рецепты клонат быть специфическим протеина, и пока дорабатывать любимейшее смешивание для того чтобы одеть новая цель протеина стандартный подход, более часто чем не, везение играет значительно роль в поколении высокомарочных кристаллов протеина.

Второй Коэффициент Virial

Второй virial коэффициент (A2) термодинамическое свойство описывая прочность взаимодействия между протеином и растворителем. Для систем протеин-растворителя с A2 > 0, протеин «любит растворитель сам» больше чем и клонит быть soluble. Когда A2 = 0, растворитель описано как растворитель тэты, показывая что прочность взаимодействия частиц-растворителя соответствующа к прочности взаимодействия частиц-частицы. Когда A2 << 0, протеин «любит» очень больше чем растворитель, и клонит суммировать в аморфический преципитат. Когда A2 как раз немножко отрицательное однако, условия идеально для выращивания кристаллов протеина на насыщать концентрацию (Диаграмму 1).

Диаграмма 1. показатель успеха Выращивания кристаллов как функция 2-ого virial коэффициента (A2).

Измерение Второго Коэффициента Virial

2-ой virial коэффициент типично измерен используя статические методы светлый (SLS) разбрасывать. Выражение Rayleigh используемое для того чтобы описать разбрасывать света от частиц более малых чем длина волны света случая уступано Уровнение 1, где K оптически константа, C концентрация частицы, M вес среднего веса молекулярный, A2 2-ой virial коэффициент, и Rè коэффициент Rayleigh разбросано к интенсивности света случая.

(1)

Как очевидно в Уровнении 1, KC/Rè должно быть линейным с концентрацией, с перехватом равным к 1/M и наклону который пропорциональн к A.2

Второй Коэффициент Virial и Оптимальное Выращивание Кристаллов

Польза 2-ого virial коэффициента как параметр скрининга для оптимальных условий выращивания кристаллов была сперва предлагает Уилсоном et al., который определили окно кристаллизации как -0,8 x 10-4 > A2 > -8,0 x 10-4 (mol mL/g2). Этот шлиц окна или кристалла кристаллизации выделен как зона II в Диаграмме 2, на которую показано статические результаты светлый разбрасывать для лизозима на различной концентрации соли в буфере укусной кислоты (пэ-аш 4).

Диаграмма 2. графики Debye для лизозима на различной концентрации NaCl в буфере укусной кислоты на пэ-аш 4. Серый выделять в зоне II, определяет шлиц кристаллизации, где -0,8 x 10-4 > A2 > -8,0 x 10.-4

Определение Связанное Проблемами Второго Коэффициента Virial

Пока crystallographers наслаждались успехом используя окно кристаллизации для того чтобы установить условия оптимального разрешения, число измерений, и следовательно время необходимы (вверх 2 часов), оценить A2 для одиночного растворителя может быть проблемн, в частности для оцениватьизыскивая высокий подход к объём к скринингу протеина кристаллическому.

Динамический Светлый Разбрасывать

DLS метод который комплементарн к статический светлый разбрасывать, и может быть выполнено на масштабе времени измеренном в минутах вернее чем часы. В DLS, разбрасывая интенсивность зыбкост проконтролированы через масштабы времени µs и после этого сопоставлены. Зыбкост интенсивности последствие движения частицы, и измеренное свойство в корреляционном анализе распределение коэффициентов диффузии. Размер после этого высчитан используя уровнение Гладить рукой-Эйнштейна (Eq. 2), где RH гидродинамический радиус, k константа Boltzmann, T температура, ç растворяющая выкостность и D коэффициент диффузии.

(2)

Dynamic Light Scattering and Particle Size Determination

Figure 3 shows a representative particle size distribution determined using DLS. Since the scattering intensity is ~ proportional to the particle molecular weight, DLS is very sensitive to aggregation and large impurities, even at low concentrations.

Figure 3. Representative DLS intensity particle size distribution.

As such, the technique is ideally suited for distinguishing samples that are unlikely to yield high quality crystals, due to the presence of impurities or non-specific aggregates, i.e. solutions residing in zone III of a Debye plot (Figure 2) where A2 << 0.

Dynamic Light Scattering and Aggregation

Figure 4 shows a comparison of the types of aggregation observed at both high and low concentration for typical protein samples, along with typical size distributions measured using DLS. The rule of thumb target for crystal screening using DLS is ~20% polydispersity (Pd), i.e. if the Pd < ~20% the sample is considered to be an ideal single population with no aggregates present. If the Pd > 20% on the other hand, the presence of non-specific aggregates, various oligiomeric states, and/or impurities decreases the likelihood of high quality crystal generation.

Figure 4. Schematic showing the types of aggregation observed at low and high concentration for typical protein samples. The A2 зоны те детализированные в графиках Debye показанных в Диаграмме 2, и распределения по размеру представитель тех измеренных для каждой зоны на разбавленной концентрации используемой для статических и динамических измерений светлый разбрасывать. Заметьте что %Pd = (½ x 100 Индекса Polydispersity).

Динамические Светлый Разбрасывать и Скрининг Кристаллизации

Как показано в Диаграмме 4, DLS можно использовать для того чтобы экранировать 2 из 3 условий разрешения которые маловероятны для ведения к высокомарочному выращиванию кристаллов, т.е. пробует с большими примесями и образцами с A <2 -8,0 x 10 mol-4 mL/G. Вообще2 однако, DLS не может различить образцы в зоне I, где протеин слишком soluble для того чтобы произвести кристаллы, от тех в пределах зоны II (шлиц кристаллизации), где условия оптимальны для высокомарочного кристаллического поколения. С другой стороны, выращивание кристаллов по существу процесс комплексирования, и как таковой, исследователя вообще зондируют границу между зонами II и III, вернее чем границей между зонами I и II. Так пока DLS не может быть серебряными исследователями пули надеялось что оно было, она все еще выполняет важную роль в своей способности экранировать вне образцы которые маловероятны для того чтобы произвести высокомарочные кристаллы.

EndoPG I Экранируя

Общий механизм для нарушения клеток завода патогеническими microbials ферментационное ухудшение пектина в клеточной оболочке EndoPG I, glycosylated микробная гидролаза. В недавних изучениях, Kato et al. могли разрешить кристаллические структуры 3 форм EndoPG I от purpureum Stereum - EndoPG Ia, с 2 цепями сахара, EndoPG Ic, с 4 цепями сахара, и De-EndoPG Ia, de-glycosylated формой EndoPG Ia. Исследователя были неспособны выкристаллизовывать четвертую форму энзима, EndoPG Ib, с 3 цепями сахара в протеин, и сообщенным затруднением в получать кристаллы качества для формы Ic EndoPG энзима.

Динамический Светлый Разбрасывать и EndoPG I Экранируя

Pre-Кристл изучает для характеризации EndoPG I включенной проектом DLS под разбавленными условиями. Результаты DLS для изучения показаны в Диаграмме 5, на которую показано значения polydispersity 7,4%, 14,9%, и 21,2% для 3 форм протеина где были получены кристаллы и 29,1% для формы которая не сумела произвести кристаллы. Эти результаты последовательны с эмпирическим способом Pd ~20% для скрининга DLS кристаллического.

Диаграмма 5. результаты DLS (Pd = polydispersity) от характеризации pre-Кристл 4 форм EndoPG I и кристаллических фото. получено и 29,1% для формы которая не сумела произвести кристаллы. Эти результаты последовательны с эмпирическим способом Pd ~20% для скрининга DLS кристаллического.

Система Zetasizer Nano

Система Zetasizer Nano от Аппаратур Malvern первая коммерчески аппаратура для того чтобы включить оборудование и ПО для совмещенных динамических, статических, и электрофорезных измерений светлый разбрасывать. Широкий диапазон свойств образца доступных для измерения с системой Zetasizer Nano включает, размер частицы, молекулярный вес, и потенциал zeta.

Система Zetasizer Nano специфически была конструирована для того чтобы соотвествовать низкие тома концентрации и образца типично связанные с фармацевтическими и биомолекулярными применениями, вместе с требованиями к высокой концентрации для коллоидных применений. Удовлетворять это уникально смешивание требований был совершен через внедрение оптической системы backscatter и конструкции романной камеры клетки. Как последствие этих характеристик, спецификации Zetasizer Nano для размера выборки и концентрация далеко опередили те для любой другой имеющей на рынке динамической аппаратуры светлый разбрасывать.

Диаграмма 6. система Zetasizer Аппаратур Malvern Nano.

Примечание: Полный набор справок может быть получен путем ссылаться к исходному документу.

Источник: «Динамический Светлый Разбрасывать - Серебряная Пуля Для Скрининга Протеина Кристаллического? », Примечание по Применению Аппаратурами Malvern.

Для больше информации на этом источнике пожалуйста посетите Аппаратуры Ltd Malvern (ВЕЛИКОБРИТАНИЮ) или Аппаратуры Malvern (США).

Date Added: May 13, 2005 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 01:45

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit