ProteinKristallisering som Avskärmer, Genom Att Använda den Dynamiska Ljusa Spridningen som Använder Utrustning Från Malvern, Instrumenterar

Täckte Ämnen

Bakgrund
     Tillväxt av ProteinKristaller
     Understödja Samverka Virial
     Mätning av Understödja Samverka Virial
     Understödja Virial Samverka och Optimal Crystal Tillväxt
Tillhörande Beslutsamhet för Problem av Understödja Samverka Virial
     Dynamisk Ljus Spridning
     Den Dynamiska Ljusa Spridningen och Partikeln Storleksanpassar Beslutsamhet
     Dynamisk Ljus Spridning och Aggregation
Dynamiskt Ljust Avskärma för Spridning och för Kristallisering
EndoPG Mig som Avskärmer
     Dynamisk Ljus Spridning och EndoPG Mig som Avskärmer
Zetasizer Nano System

Bakgrund

I tidig sort90-tal introducerades den dynamiska ljusa (DLS) spridningen, som avskärma bearbetar för crystallography. Över det förgångna årtiondet har DLS blivit brett accepterad i denna roll, och den dynamiska ljusa spridningen instrumenterar nu integreras rutinmässigt in i Röntgar crystallographylabb. En allmänningmissuppfattning emellertid, är att DLS kan berätta en vilken tar prov är rimlig till avkastningkristaller. I praktiken används DLS lämpligare, som en bearbeta för att avskärma ut tar prov som är osannolik till avkastningkristaller. I denna artikel tilltalar vi den subtila skillnaden i dessa pekar och undersöker värdera av ljusa spridningtekniker, som att avskärma för kristall bearbetar.

Tillväxt av ProteinKristaller

Klassa som bestämmer, kliver i upplösningen av kristallen strukturerar identifierar optimaln villkorar för högkvalitativ crystal tillväxt. Det finns en multitude av reagents för utveckling ”av soupsna” från vilka högkvalitativa kristaller är fullvuxna. Emellertid ansar alla recept för att vara proteinnärmare detalj, och stunder som ändrar en favorit- blandning för att passa ett nytt protein, uppsätta som mål är det standart att närma sig, oftare än inte, lyckalekar en viktig roll i utvecklingen av högkvalitativa proteinkristaller.

Understödja Samverka Virial

Det virial samverka för understödja (A2) är en thermodynamic egenskap som beskriver växelverkanstyrkan mellan proteinet och vätskan. För protein-vätska system med gillar2 ansar A > 0, proteinet ”vätskan” mer än sig själv och för att vara lösligt. När A2 = 0, vätskan beskrivas som en thetavätska som indikerar att partikel-vätskan växelverkanstyrka är likvärdigt till partikel-partikeln växelverkanstyrka. När A2 << 0, proteinet ”gillar sig” mycket mer än, ansar vätskan, och för att samla in i amorphous påskyndar. (Figurera2 1), När A är precis litet negationen emellertid, villkorar är ideal för crystal tillväxt för protein på att genomdränka koncentrationer.

Figurera 1. Crystal tillväxtframgång klassar som en fungera av det 2nd virial samverka (A2).

Mätning av Understödja Samverka Virial

Det 2nd virial samverka mätas typisk genom att använda spridningtekniker för statisk elektricitet (SLS) lätt. Det van vid Rayleigh uttryckt beskriver spridningen av ljust från mindre partiklar, än våglängden av incidentet ges lätt i Likställande 1, var K är en optisk konstant, C är partikelkoncentrationen, är M det molekylära vägagenomsnittet väger, är2 A det 2nd virial samverka, och Rè är det Rayleigh förhållandet av spritt till styrka för incidentet lätt.

(1)

Som tydligt i Likställande 1, bör KC/Rè vara linjär med koncentration, med en fånga uppjämlike till 1/M och en slutta som är proportionell till A.2

Understödja Virial Samverka och Optimal Crystal Tillväxt

Bruket av det 2nd virial samverka, som en avskärma parameter för optimal crystal tillväxt villkorar, var föreslår först av Wilson o.a., som definierade kristalliseringsfönstret som -0,8 x 10-4 > A2 > -8,0 x 10-4 (mol mL/G2). Denna kristalliseringsfönster- eller kristallspringa markeras som zonplanerar II Figurerar in 2, som visar att de ljusa spridningresultaten för statisk elektricitet för lysozyme på olika salt koncentrationer i ättiksyra fungera som buffert (pH 4).

Figurera 2. Debye täppor för lysozyme på olika NaCl-koncentrationer i ättiksyra fungera som buffert på pH 4. Grå färg som in markerar, zonplanerar II, definierar kristalliseringsspringan, var -0,8 x 10-4 > A2 > -8,0 x 10-4.

Tillhörande Beslutsamhet för Problem av Understödja Samverka Virial

Stundcrystallographers har tyckt om framgång genom att använda kristalliseringsfönstret för att upprätta den optimala lösningen villkorar, numrera av mätningar, och hence kan tiden som krävs (uppåt av 2 timmar), för att utvärdera2 A för en singelvätska vara problematisk, bestämt för de som söker en kickgenomgång, att närma sig till crystal avskärma för protein.

Dynamisk Ljus Spridning

DLS är en teknik, som är kompletterande till den ljusa spridningen för statisk elektricitet, och kan utföras på ett tidfjäll som in mätas, noterar ganska än timmar. I DLS övervakas korreleras spridningstyrkeväxlingar över µstidfjäll och därefter. Styrkeväxlingarna är en följd av partikeln vinkar, och den mätte egenskapen i korrelationanalysen är fördelningen av diffusionskoefficienter. Storleksanpassa beräknas därefter genom att använda denEinstein likställanden (Eq. 2), var RH är den hydrodynamic radien, K är den Boltzmann konstanten, är T temperaturen, är ç vätskeklibbigheten, och D är den samverka diffusionen.

(2)

Dynamic Light Scattering and Particle Size Determination

Figure 3 shows a representative particle size distribution determined using DLS. Since the scattering intensity is ~ proportional to the particle molecular weight, DLS is very sensitive to aggregation and large impurities, even at low concentrations.

Figure 3. Representative DLS intensity particle size distribution.

As such, the technique is ideally suited for distinguishing samples that are unlikely to yield high quality crystals, due to the presence of impurities or non-specific aggregates, i.e. solutions residing in zone III of a Debye plot (Figure 2) where A2 << 0.

Dynamic Light Scattering and Aggregation

Figure 4 shows a comparison of the types of aggregation observed at both high and low concentration for typical protein samples, along with typical size distributions measured using DLS. The rule of thumb target for crystal screening using DLS is ~20% polydispersity (Pd), i.e. if the Pd < ~20% the sample is considered to be an ideal single population with no aggregates present. If the Pd > 20% on the other hand, the presence of non-specific aggregates, various oligiomeric states, and/or impurities decreases the likelihood of high quality crystal generation.

Figure 4. Schematic showing the types of aggregation observed at low and high concentration for typical protein samples. The A2 zonplanerar är de som specificeras i Debyen som täppor som in visas, Figurerar 2, och storleksanpassafördelningorna är representativa av de som mätas för varje, zonplanerar på de utspädda koncentrationerna som används för statisk elektricitet och dynamiska ljusa spridningmätningar. Notera att %Pd = ½ x 100 (för PolydispersityIndexet).

Dynamiskt Ljust Avskärma för Spridning och för Kristallisering

Som visat in Figurera 4, kan DLS vara van vid avskärmer 2 ut ur 3na som lösningen villkorar, som är osannolik att leda till högkvalitativ crystal tillväxt, dvs. tar prov med stora impurities och tar prov med A <2 -8,0 x 10 mol-4 mL/G. I allmänhet2 though, kan DLS inte skilja tar prov zonplanerar in I, var proteinet är för lösligt till jordbruksprodukterkristaller, från de within zonplanerar II (kristalliseringsspringan), var villkorar är optimalt för högkvalitativ crystal utveckling. Å andra sidan är crystal tillväxt naturligt en aggregation som är processaa, och som sådan, sonderar forskare allmänt gränsen between zonplanerar II, och III, ganska än gränsen between zonplanerar I och II. Så kan stunder DLS inte vara försilvrakulforskarna hoppas det skulle är, det som är stilla, uppfyller en viktig roll i dess kapacitet att avskärma ut tar prov som är osannolika till högkvalitativa kristaller för jordbruksprodukter.

EndoPG Mig som Avskärmer

En allmänningmekanism för söndringen av växtceller vid pathogenic microbials är den enzymatic degraderingen av pectin i cellväggen vid EndoPGen Mig, en glycosylated mikrobiell hydrolase. I nya studier var Kato o.a. kompetent att lösa kristallen strukturerar av tre bildar av EndoPGen Mig från den Stereum purpureumen - EndoPGen Ia, med socker två kedjar, EndoPGen Ic, med socker fyra kedjar, och De-EndoPGen Ia, detglycosylated bildar av EndoPGen Ia. Forskarna var oförmögna att kristallisera en fourth bildar av enzymet, EndoPGen Ib, med socker tre kedjar per protein, och den anmälde svårigheten, i att erhålla kvalitets- kristaller för EndoPGen Ic, bildar av enzymet.

Dynamisk Ljus Spridning och EndoPG Mig som Avskärmer

Pre-kristallen studierna för EndoPGen som Jag projekterar inklusive DLS-karakterisering under utspätt, villkorar. DLS-resultaten för studien visas in Figurerar 5, som indikerar att polydispersity värderar av 7,4%, 14,9%, och 21,2% för proteinet tre bildar var kristaller erhölls och 29,1% för bilda som missade till jordbruksprodukterkristaller. Dessa resultat är jämna med den ~20% Pd-tumregeln för crystal avskärma för DLS.

Figurera 5. DLS-resultat (Pd = polydispersity) från pre-kristallen karakteriseringen av fyrana bildar av EndoPGen Mig och crystal foto. erhållande och 29,1% för bilda som missade till jordbruksprodukterkristaller. Dessa resultat är jämna med den ~20% Pd-tumregeln för crystal avskärma för DLS.

Zetasizer Nano System

Zetasizer det Nano systemet från Malvern Instruments är den första reklamfilmen instrumenterar för att inkludera maskinvaran och programvaran för kombinerat dynamiskt, statisk elektricitet och electrophoretic ljusa spridningmätningar. Lång räcka av tar prov rekvisita som är tillgänglig för mätningen med Zetasizeren som det Nano systemet inkluderar, storleksanpassar partikeln, molekylärt väga, och den potentiella zetaen.

Zetasizer det Nano systemet planlades specifikt för att möta den låga koncentrationen och för att ta prov volymkrav som typisk var tillhörande med farmaceutiska och biomolecular applikationer, tillsammans med kickkoncentrationskraven för colloidal applikationer. Att Tillfredsställa denna unika blandning av krav var fulländat via integrationen av ett optiskt system för backscatter och designen av en ny cellkammare. Som en följd av dessa presenterar, Zetasizer tar prov de Nano specifikationerna för storleksanpassar, och koncentration överskrider långt de för någon annat kommersiellt - den tillgängliga dynamiska ljusa spridningen instrumenterar.

Figurera 6. Malvern Instrumenterar Zetasizer det Nano systemet.

Notera: En färdig uppsättning av hänvisar till kan erhållas, genom att se till källdokumentet.

Källa: ”Dynamisk Ljus Spridning - FörsilvraKulan För Crystal Avskärma för Protein? ” Noterar Applikationen vid Malvern Instrumenterar.

För mer information på denna källa behaga besök Malvern Instrumenterar AB (UK), eller Malvern Instrumenterar (USA).

Date Added: May 13, 2005 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 01:51

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit