Paksa sakop
Likuran
Paglago ng mga Kristal na ng protina
Ang Ikalawang Virial koepisyent
Sukatan ng Ikalawang Virial koepisyent
Ang Ikalawang Virial koepisyent at pinakamainam na Crystal Paglago
Problema sa Associated pagpapasiya ng Ang Ikalawang Virial koepisyent
Dynamic Banayad Scattering
Dynamic Banayad Scattering at pagpapasiya ng tinga Sukat
Dynamic Banayad Scattering at pagsasama-sama
Dynamic Banayad Scattering at Crystallisation screening
EndoPG ko screening
Dynamic Banayad Scattering at EndoPG ko screening
Zetasizer Nano System
Likuran
Sa unang bahagi ng 1990s, dynamic light scattering (DLS) ay ipinakilala bilang isang tool ng screening para sa crystallography . Sa loob ng nakaraang dekada DLS ay naging malawak na tinanggap sa papel na ito, at dynamic light scattering instrumento na ngayon ang regular na isinama sa X-ray crystallography labs. Ang isang karaniwang maling kuru-kuro gayunpaman, ay na ang mga DLS maaaring sabihin sa isa kung aling mga halimbawa ay malamang na ani kristal. Sa pagsasanay, DLS ay mas naaangkop na ginamit bilang isang kasangkapan para sa screening ang mga halimbawa na ay malamang na hindi sa ani ng mga kristal. Sa artikulong ito, address namin ang matalisik pagkakaiba sa mga puntong ito, at suriin ang halaga ng ilaw scattering pamamaraan ng mga gamit ng screening ng kristal.
Paglago ng mga Kristal na ng protina
Ang rate sa pagtukoy ng hakbang sa resolution ng mga kaayusan ng kristal ay pagkilala sa mga pinakamabuting kalagayan na kondisyon para sa mataas na kalidad na kristal paglago. May isang tao ng mga reagents para sa pagbuo ng "soups" mula sa kung saan ang mga de-kalidad na kristal ay lumago. Gayunpaman, ang lahat ng recipes posibilidad na ang mga protina tiyak, at habang ang pagbabago ng isang paborito Halo upang umangkop sa isang bagong target na protina ay ang karaniwang diskarte, mas madalas kaysa sa hindi, ang kapalaran ay gumaganap ng isang makabuluhang papel sa henerasyon ng mga mataas na kalidad ng protina kristal.
Ang Ikalawang Virial koepisyent
Ang ikalawang virial koepisyent (A 2) ay isang thermodynamic ari-arian na naglalarawan ang lakas ng pakikipag-ugnayan sa pagitan ng mga protina at ang nakatutunaw. Para sa mga protina-pantunaw system sa isang 2> 0, protina ang "paggusto ang pantunaw" higit sa sarili at tends sa ay natutunaw. Kapag A 2 = 0, ang panunaw ay inilarawan bilang isang nakatutunaw theta, na nagpapahiwatig na tinga-pantunaw lakas ng pakikipag-ugnayan ay katumbas ng pakikipag-ugnayan lakas ng tinga- tinga. Kapag A 2 <<0, protina ang "paggusto mismo" mas higit pa kaysa sa panunaw, at tends sa pinagsama-samang sa walang hugis namuo . Kapag ang isang 2 ay lamang bahagyang negatibong gayunpaman, ang mga kondisyon ay mainam para sa paglago ng protina kristal sa concentrations sa saturating (Figure 1).
Figure 1. Crystal rate ng tagumpay ng paglago bilang isang function ng 2nd virial koepisyent (A 2 ).
Sukatan ng Ikalawang Virial koepisyent
Ang 2nd virial koepisyent ay karaniwang sinusukat paggamit ng mga static na light scattering (SLS) na mga pamamaraan. Ang Rayleigh expression na ginamit upang ilarawan ang scattering ng ilaw mula sa particle na mas maliit kaysa sa weyblengt ng ilaw ng pangyayari ay ibinigay sa Equation 1, kung saan K ay isang optical pare-pareho, C ang tipik konsentrasyon, M ay ang bigat average na molekular timbang, 2 ay 2nd virial koepisyent, at muling Rayleigh ratio ng mga nakakalat sa insidente ilaw iting.
(1)
Bilang maliwanag sa Equation 1, KC / RE dapat na guhit sa kampo, na may isang humarang na katumbas sa 1 / M at isang libis na proporsyonal sa isang 2 .
Ang Ikalawang Virial koepisyent at pinakamainam na Crystal Paglago
Ang paggamit ng 2nd virial koepisyent bilang isang parameter ng screening para sa optimal sa mga kondisyon ng kristal paglago ay unang iminumungkahi ni Wilson et al., Na tinukoy ng pagkikristal window bilang -0.8 x 10 -4> A 2> -8.0 x 10 -4 (Mol ML / g 2). Ito pagkikristal window o puwang ng kristal ay naka-highlight ng zone II sa Figure 2, na kung saan nagpapakita ang static na liwanag mga resulta scattering para sa lysozyme sa iba't-ibang concentrations asin sa asetiko acid buffer (ph 4).
Figure 2. Debye plots para lysozyme sa iba't ibang NaCl concentrations sa asetiko acid buffer sa ph 4. Ang kulay abo na-highlight sa zone II, tumutukoy ang pagkikristal slot, kung saan -0.8 x 10 -4> A 2> -8.0 x 10 -4 .
Problema sa Associated pagpapasiya ng Ang Ikalawang Virial koepisyent
Habang crystallographers kinawiwilihan tagumpay gamit ang window ng pagkikristal upang maitaguyod ang mga kondisyon ng pinakamainam na solusyon, ang bilang ng mga sukat, at samakatuwid ang oras na kinakailangan (paitaas ng 2 oras), upang suriin ang isang 2 para sa isang solong pantunaw maaaring problemang, lalo na para sa mga naghahanap ng isang mataas na throughput diskarte sa kristal screening ng protina.
Dynamic Banayad Scattering
DLS ay isang pamamaraan na ay kakontra sa static light scattering, at maaaring gumanap sa isang oras scale na sinusukat sa mga minuto kaysa sa oras. Sa DLS , scattering kasidhian pagbabago ay sinusubaybayan sa μs kaliskis oras at pagkatapos ay sang-ayon. Ang mga kasidhian pagbabago ang kalalabasan ng tinga paggalaw, at ang nasukat na ari-arian sa pagtatasa ugnayan ay ang pamamahagi ng mga coefficients ng pagsasabog. Laki pagkatapos ay kinakalkula gamit ang Stokes-Einstein equation (Eq. 2), kung saan RH ang hydrodynamic radius, k ang Boltzmann pare-pareho, ang T ay ang temperatura, C ay ang nakatutunaw lapot at ang D ay ang pagsasabog koepisyent.
(2)
Dynamic Banayad Scattering at pagpapasiya ng tinga Sukat
Figure 3 nagpapakita ng isang kinatawan tipik laki pamamahagi tinutukoy gamit DLS . Dahil ang kasidhian ng scattering ay ~ proporsyonal sa tinga ang molekular timbang , DLS ay masyadong sensitibo sa pagsasama-sama at malaki impurities, kahit na sa mababang concentrations.
Figure 3. Representative kasidhian DLS tipik laki pamamahagi.
Dahil dito, ang pamamaraan ay kainaman angkop para sa mga tangi ang mga halimbawa na ay malamang na hindi magbunga ng mga kristal ng mataas na kalidad, dahil sa pagkakaroon ng mga impurities o di-tiyak na mga aggregates, ie solusyon na nakatira sa zone III ng isang balangkas ng Debye (Figure 2) kung saan A2 << 0.
Dynamic Banayad Scattering at pagsasama-sama
Figure 4 ay nagpapakita ng isang paghahambing ng mga uri ng pagsasama-sama na sinusunod sa parehong mataas at mababang concentration para sa mga karaniwang halimbawa ng protina, kasama ang mga karaniwang sukat distribusyon na sinusukat gamit DLS. Ang mga alituntunin ng hinlalaki target para sa screening ng kristal gamit DLS ~ 20% polydispersity (PD), ie kung ang PD <~ 20% na ang sample ay itinuturing na isang ideal solong populasyon sa Walang aggregates kasalukuyan. Kung ang PD> 20% sa kabilang banda, ang pagkakaroon ng di-tiyak na mga aggregates, iba't-ibang mga oligiomeric estado, at / o impurities nababawasan ang posibilidad ng mataas na kalidad na kristal na henerasyon.
Figure 4. Eskematiko nagpapakita ang mga uri ng pagsasama-sama na sinusunod sa mababa at mataas na konsentrasyon para sa mga karaniwang halimbawa ng protina. Ang isang 2 zone ay ang mga detalyadong sa plots Debye na ipinapakita sa Figure 2, at ang laki distribusyon ay kinatawan ng mga sinusukat para sa bawat zone sa magpalabnaw concentrations ginagamit para sa mga static at dynamic na mga sukat ng ilaw scattering. Tandaan na% PD = (Polydispersity Index) ½ x 100.
Dynamic Banayad Scattering at Crystallisation screening
Tulad ng ipinapakita sa Figure 4, ang mga DLS ay maaaring gamitin sa screen ng 2 ng 3 kundisyon sa solusyon na ay malamang na hindi humantong sa mataas na kalidad ng paglago kristal, ie halimbawa sa mga malalaking mga impurities at mga halimbawa sa isang 2 <-8.0 x 10 -4 Mol ML / g 2. Sa pangkalahatan bagaman, DLS hindi maaaring makilala ang mga halimbawa sa zone ko, kung saan protina ay masyadong natutunaw upang makagawa ng mga kristal, mula sa mga sa loob ng zone II (pagkikristal slot), kung saan ang mga kondisyon ay pinakamainam para sa mataas na kalidad na kristal henerasyon. Sa kabilang banda, ang paglago ng kristal ay likas na proseso ng isang pagsasama-sama, at bilang tulad, ang mga mananaliksik ay pangkalahatan probing ang hangganan sa pagitan ng zone II at III, sa halip na ang hangganan sa pagitan ng zone I at II. So habang DLS ay maaaring hindi ang silver bullet mananaliksik ay hoping na ito, pa rin ito fulfills isang mahalagang papel sa kanyang kakayahan sa screen ang mga halimbawa na ay malamang na hindi makagawa ng mataas na kristal kalidad.
EndoPG ko screening
Ang isang karaniwang mekanismo para sa pagputol ng mga cell ng halaman sa pamamagitan ng microbials pathogenic enzymatic marawal na kalagayan ng pektin sa cell sa pader sa pamamagitan ng EndoPG ko, isang glycosylated hydrolase microbial. Sa kamakailang pag-aaral, Kato et al. nagawa upang malutas ang kristal na istraktura ng tatlong paraan ng EndoPG ko mula sa Stereum purpureum- EndoPG Ia , Na may dalawang chains asukal, EndoPG IC, na may apat na chains asukal, at De-EndoPG Ia , Ang de-glycosylated form ng EndoPG Ia. Ang mga mananaliksik ay hindi gawing kristal ang isang ika-apat na form ng enzyme, EndoPG Ib, sa may tatlong chains ng asukal sa bawat protina, at iniulat ang nahihirapan sa pagkuha ng mga kristal ng kalidad para sa EndoPG na form IC ng ng enzyme.
Dynamic Banayad Scattering at EndoPG ko screening
Ang pre-kristal na pag-aaral para sa EndoPG proyekto kasama ko ang DLS paglalarawan sa ilalim ng maghalo kundisyon. Ang mga DLS ng mga resulta para sa pag-aaral ay ipinapakita sa Figure 5, na nagpapahiwatig ng mga halaga polydispersity ng 7.4%, 14.9%, at 21.2% para sa tatlong mga form protina na kung saan ang mga kristal ay nakuha at 29.1% para sa mga form na nabigo upang makagawa ng kristal. Ang mga resulta na ito ay pare-pareho sa na ~ 20% PD alituntunin ng hinlalaki para sa DLS kristal screening.
Figure 5. DLS resulta (PD = polydispersity) mula sa pre-kristal na paglalarawan ng apat na paraan ng EndoPG ko at mga larawan ng kristal. nakuha at 29.1% para sa mga form na nabigo upang makagawa ng kristal. Ang mga resulta na ito ay pare-pareho sa na ~ 20% PD alituntunin ng hinlalaki para sa DLS kristal screening.
Zetasizer Nano System
Ang Zetasizer Nano sistema mula Malvern Instrumentong ay ang unang komersyal na instrumento upang isama ang hardware at software para sa mga pinagsamang dynamic, static, at electrophoretic sukat ng ilaw scattering. Ang malawak na hanay ng mga katangian ng sample na magagamit para sa pagsukat sa Zetasizer Nano sistema isama, laki ng tinga, molekular timbang, at Zeta potensyal.
Ang Zetasizer Nano sistema ay partikular na dinisenyo upang matugunan ang mababang konsentrasyon at sample-dami ng mga kinakailangan karaniwang na nauugnay sa mga pharmaceutical at biomolecular application, kasama ang mataas na kinakailangan na konsentrasyon para sa koloidal application. Nagbibigay-kasiyahan ang natatanging halo ng mga kinakailangan ay nagagawa sa pamamagitan ng pagsasama ng isang sistema backscatter optical at ang disenyo ng isang silid ng nobelang ng cell. Bilang kalalabasan ng mga tampok na ito, ang Zetasizer Nano mga pagtutukoy para sa laki ng sample at concentration ay malayo lumampas ang mga para sa anumang iba pang mga komersyal magagamit na dynamic instrumento light scattering.
Figure 6. Malvern Instrumentong Zetasizer Nano sistema.
Tandaan: Ang isang kumpletong hanay ng mga sanggunian ay maaaring makuha sa pamamagitan ng nagre-refer sa pinagmulan ng dokumento.
Source: "Dynamic Scattering Banayad - Ang Silver Bullet Para sa protina Crystal screening?", Application Tandaan ng Malvern Instrumentong.
Para sa karagdagang impormasyon sa pinagmulan, mangyaring bisitahin ang Malvern Instrumentong Ltd ( UK ) o Malvern Instrumentong ( USA ).