| Atomkraftmikroskopie (AFM) liefert die Fähigkeit, dreidimensionale Maße von Oberflächenzellen nm--subangstrom an Auflösung in den umgebenden und flüssigen Umgebungen durchzuführen. Diese Fähigkeiten haben zu den bahnbrechenden Biowissenschaften Fortschritte in der Untersuchung von DNS, von Proteinen und von Zellen geführt. Insbesondere bezieht pharmazeutische Forschung einige Anwendungen mit ein, die schnell von FLUGHANDBUCH profitieren, als unabhängige Technik und als starke Ergänzung zu den anderen geläufigen analytischen zur Zeit verfügbaren Techniken. Diese Anwendungsanmerkung prüft, wie FLUGHANDBUCH die eindeutige Fähigkeit der direkten, einzelnen Untersuchung der GenTrägerwaffen an der hohen Auflösung in einem hydratisierten Zustand anbietet. FLUGHANDBUCHGeschichte und -methoden FLUGHANDBUCH ist das allgemein verwendetste Formular der Scannenfühler-Mikroskopie (SPM)familie von Techniken. Der Ursprung von SPM fing mit der Entwicklung des Scannentunnelbaumikroskops (STM) im Jahre 1982 durch Forscher an IBM, Zürich an. Die Fähigkeit STMS, Atomzelle auf einer Beispieloberfläche zu lösen erwarb den Erfindern den Nobelpreis im Jahre 1986. Jedoch kann STM an den leitfähigen oder semiconductive Probenmaterialien nur angewendet werden. Um dieses Baumuster von Mikroskopie zur Studie von Isolatoren zu erweitern, wurde das Atomkraftmikroskop in der Zusammenarbeit zwischen IBM und Universität von Stanford im Jahre 1986 entwickelt. FLUGHANDBUCH wird durchgeführt, indem man scannt eine scharfe Spitze am Ende eines flexiblen Kragbalkens über einer Beispieloberfläche, beim Beibehalten einer kleinen, konstanten Kraft (siehe Abbildung 1). 
Abbildung 1. SEM-Bild (Vergrößerung 300X) eines integrierten Silikons des einzelnen Kristalles freitragend und der Spitze mit einem Endenradius 5nm zu 10nm. Die Spitzen haben gewöhnlich einen Endenradius 5nm zu 10nm, obgleich diese abhängig von Spitzenbaumuster schwanken kann. Der Scannenantrag wird durch einen piezoelektrischen Gefäßscanner geleitet, der das Umkippung über der Probe in einem Rastermuster scannt (siehe Abbildung 2). 
Abbildung 2. Diagramm der Hauptteile eines Atomkraftmikroskops, die Rückkopplungsschleife für TappingMode-Operation zeigend. TappingMode und Kontakt-Modus FLUGHANDBUCH Die Spitzeprobe Interaktion wird geüberwacht, indem man einen Laser weg von der Rückseite des Kragbalkens auf einen Rissfotodiode Detektor reflektiert. Die allgemein verwendetste Betriebsart zwei sind Kontaktmodus FLUGHANDBUCH und TappingMode™ FLUGHANDBUCH, das in Luft- und Flüssigkeitsumgebungen geleitet werden kann. In Kontaktmodus FLUGHANDBUCH wird ein konstanter freitragender Ausschlag durch eine Rückkopplungsschleife aufrechterhalten, die den Scanner vertikal (Z) an jedem Seitenteil verschiebt (X, Y) der Datenpunkt, zum des topographischen Bildes zu bilden. Indem man einen konstanten Ausschlag während des Scannens beibehält, wird eine konstante vertikale Kraft zwischen der Spitze und der Probe aufrechterhalten. Obgleich Kontaktmodus nützliches für eine große Auswahl von Anwendungen geprüft hat, ist er nicht, wie effektiv auf verhältnismäßig weichen Proben. Andererseits besteht TappingMode FLUGHANDBUCH, der Kragbalken bei seiner Resonanzfrequenz (gewöhnlich ~300kHz) zu oszillieren und über der Oberfläche mit einer Konstante, Dämpfung Amplitude zu scannen. Die Rückkopplungsschleife behält eine konstante Rootmeanquadrat (RMS) Amplitude bei, indem sie den Scanner vertikal während des Scannens verschiebt, das entsprechend eine konstante angewandte Kraft beibehält, um ein topographisches Bild zu bilden. Der Vorteil von TappingMode ist, dass er gewöhnlich mit einer unteren vertikalen Kraft als der funktioniert, der mit Kontaktmodus möglich ist, und er beseitigt den Seitenteil, Scherkräfte, die einige Proben beschädigen können. So ist TappingMode die bevorzugte Technik für die Darstellungsweichen, empfindlichen, klebenden und Partikeloberflächen geworden. FLUGHANDBUCH in der Gen-Lieferungs-Forschung Gentherapie hat Impuls als effektive Methode für die Behandlung von genetisch-basierten Krankheiten gewonnen. Jedoch ist eins der Haupthindernisse, die diese Behandlungsform gegenüberstellen, in der Lieferung des kondensierten Genmaterials zu seinem beabsichtigten Ziel. Es gibt zwei geläufige Arten der Verpackung DNS für Genlieferung: Viren- und nonviral. Obwohl der Viren-vermittelte Modus der Genlieferung aktuell das geläufigste ist, kann er an der Aktivierung der immunologischen Antwort eines Patienten problematisches liegen, die möglicherweise die GenTrägerwaffe vor Gebrauch beseitigen und andere Gesundheitsprobleme produziert. Um diese Komplikationen zu vermeiden, werden die nonviral Fahrzeuge, die aus Liposomen heraus fabriziert werden oder die Polymere in zunehmendem Maße verwendet um die DNS oder andere einzukapseln Droge in Verbindung gestandene Materialien. FLUGHANDBUCH hat erfolgreich die Entwicklung solcher GenTrägerwaffen verbessert, indem es ein größeres Verständnis des Prozesses von DNS-Kondensation zur Verfügung stellte. Abbildung 3 zeigt nonviral DNS-Kondensate, die mit verschiedenen Ladungs-Verhältnissen gebildet wurden. 
Abbildung 3. Vier verschiedene kondensierte Zustände DNS von einer Studie von nonviral GenTrägerwaffen: A) Kondensierter negativ - aufgeladen auf NiCl2- behandelter Glimmer, B) Kondensiert - aufgeladen mit 0,2 mm NiCl, 2c) positiv Kondensiert - negativ aufgeladen, d) Noncondensed. Abhängig von der Entstehungsvorrichtung werden die Kondensate fest gepackt oder entwirrt etwas. 1ìm Scans. Variablen im Entstehungsprozeß ergeben entweder Positiv oder Negativ belastete Kondensate und produzieren verschiedene Grade DNS-Verpackung. FLUGHANDBUCH bietet einen eindeutigen Vorteil über anderen Methoden für die Untersuchung der DNS-Kondensate an. Einer der größten Vorteile ist Fähigkeit FLUGHANDBUCHS, die Zelle der Trägerwaffe in seinem hydratisierten Zustand anzusehen, da er gebräuchlich aussehen würde. Darüber hinaus mit Auflösung Nmschuppe FLUGHANDBUCHS, machen Forscher leicht Bild die DNA-Stränge ein und sehen, wie sie mit einem bestimmten Polymer oder einem Liposom reagieren und kondensieren. Keine andere Technik erlaubt direkte Untersuchung von einzelnen Fahrzeugen an der hohen Auflösung in einem hydratisierten Zustand. Zum Beispiel gibt es verschiedene Partikelbearbeiten Techniken, die eine Korngrößenverteilung über einer sehr großen Anzahl von Kondensaten produzieren, aber sie können nicht an einem einzelnen Kondensat angewendet werden. Eine der geläufigsten Techniken, die aktuell verwendet werden, ist Elektronenmikroskopie (EM), die die hohe Auflösung anbietet, die benötigt wird, um einzelne Kondensate anzusehen, aber benötigt beträchtliche Probenaufbereitungszeit und benötigt das Probenmaterial, in einer Vakuumumgebung ausgetrocknet zu werden. Da, das Austrocknen möglicherweise der GenTrägerwaffen ihre Zelle ändert, sind die Ergebnisse bestenfalls weniger nützlich. Schlimmstenfalls sind möglicherweise diese Ergebnisse irreführend und Ergebnis in den unwirksamen GenTrägerwaffen. Im Allgemeinen wird FLUGHANDBUCH auf GenTrägerwaffen zugetroffen, die in einer Lösung sind. Sie werden in die flüssige Zelle, in der sie zu einer Substratfläche befestigen, gewöhnlich Glimmer eingespritzt. Die Fahrzeuge werden auf der Glimmeroberfläche durch Ladung angehalten. Positiv - belastete Kondensate werden natürlich zur negativen Ladung der Glimmeroberfläche und negativ angezogen - belastete Kondensate können zum - belasteten Glimmer negativ angezogen werden, entweder indem man ein zweiwertiges Kation in die Lösung legt oder indem man den Glimmer mit einem Siliziumwasserstoff beschichtet, um AP-Glimmer zu bilden. FLUGHANDBUCH-Darstellung wird dann in gelöster Form über die TappingMode-Technik geleitet. Zwar einfach sich vorzubereiten und durchzuführen, ist FLUGHANDBUCH folglich in der Lage, sehr hochauflösendes auf einzelnen DNS-Kondensaten zur Verfügung zu stellen. Gen Lieferungs-Studien Es hat einige erschienene Flughandbuch-basierte Genlieferungsstudien gegeben. Dunlap und Mitarbeiter studierten Schwankungen der Kondensationsvorrichtungen des supercoiled Plasmids DNS 5-7kb in der Länge mit einem kationischen Lipid, lipospermine (dioctadecylamidoglycylspermine oder HUNDE) und einem kationischen Polymer, polyethylenimine (PEI). Die resultierenden Kondensate waren durch TappingMode in 15mM NaCl-Lösung abgebildet. Für beide HUNDE und PEI waren gefaltete DNS-Regelkreise, die von den Seelen ausstrahlen, offensichtlich und zeigten Kondensation an, indem sie gefaltete Regelkreise von DNS packten. In Abbildung 4, können Bündel DNS zusammen mit den Polymerkügelchen offenbar gesehen werden. Dieses teilweise Kondensat hat eine toroidal Zelle vom Circularization eines länglichen Kondensats mit mehrfachen Kondensationsknotenpunkten gebildet. Indem man die Konzentration von HUNDEN und von PEI sich unterschied, wurden die Bedingungen für komplette Kondensation auch nachgeforscht. Komplette PEI-Kondensate wurden gefunden, um 20 bis 40 nm im Durchmesser zu sein, während komplette HUNDEkondensate gefunden wurden, um 50 bis 70 nm zu sein. Dieses schlägt vor, dass PEI möglicherweise ein effektiverer kondensierender Agens als die HUNDE ist. Der Unterschied an Größe und die Morphologie beeinflussen möglicherweise auch ihre Leistungsfähigkeit als Transfectionsagens. 
Abbildung 4. Nonviral-Genlieferung mit kondensierter DNS und einem Polymer. Orangeviolet-Kügelchen von polyethylenimine (PEI), ein kationisches Polymer, stabilisierte Kreisbündel gelbgrüner DNS schlingt sich in einem Plasmid des Kilobase fünf. Gelöste Moleküle waren in TappingMode in der 15mM Salzlösung abgebildet. FLUGHANDBUCH ist auch zu den dynamischen Prozessen des Bildes in situ verwendet worden, um ein besseres Verständnis der Entstehungsvorrichtungen zu gewinnen, die mit DNS-Kondensation verbunden sind. Kondensation von pegylated Poly (Amidoamin) mit DNS ist in der wässerigen Lösung in der Istzeit beobachtet worden. Die Gesamtpositive ladung des Kondensats PolymerDNS wurde verwendet, um die Kondensate zum - belasteten Glimmer elektrostatisch negativ anzuhalten. Jedoch wurde es so steif nicht hinsichtlich verhindert Bewegung der Kondensate während ihrer Entstehung angehalten. Darstellung der Kondensate zeigte in gelöster Form das Vorhandensein von toroidal und Gestänge ähnlichen Kondensatzellen an. In Abbildung 5, kann die Entstehung eines toroidal Kondensats über einer Zeitspanne von 35 Minuten gesehen werden. Von diesen Bildern scheint die toroidal Zelle, gebildet zu werden, indem sie den Enden eines Gestänge ähnlichen Kondensats sich anschließt. 
Abbildung 5. Entstehung toroidal DNS-Polymer Kondensats über winziger Zeitspanne 35. Maßstabsbalken = 200nm. Weitere Untersuchungen haben das Bestehen von Gestänge ähnlichen und toroidal Zellen in einem Zustand des dynamischen Gleichgewichts gezeigt, wenn die Kondensate von Gestänge ähnlichem ändern, zu toroidal und zu toroidal zu den Gestänge ähnlichen Zellen. Das Studieren der dynamischen Prozesse in der Istzeit macht es möglich, ein besseres Verständnis der Kinetik des Kondensationsprozesses zu gewinnen, der zu beträchtliche Verbesserungen in der Genlieferung führen könnte. Schlussfolgerung FLUGHANDBUCH hat Erfolg gezeigt, wenn es nanoscale, in-situ-DNS-Zellen studierte. Dieses hat eine offensichtliche Bedeutung zu den Bemühungen, effektivere GenTrägerwaffen zu entwickeln. Forscher verwenden den vielen Nutzen der Flughandbuch-en-hoh Auflösung, vereinfachte Probenaufbereitung, Echtzeituntersuchung, zerstörungsfreie Darstellung, und die Fähigkeit, Flüssigkeit-zu herein durchzuführen forschen DNS-Kondensationsvorrichtungen und verschiedene Gen-Verpackenmaterialien nach. Obgleich die Beispiele, die oben behandelt werden, gerade ein Musterstück der Arbeit sind, die mit Atomkraftmikroskopen in den Genlieferungsstudien durchgeführt worden ist, zeigen sie an, wie wichtig das FLUGHANDBUCH zur Zukunft der Gentherapie ist. Der eindeutige Nutzen von FLUGHANDBUCH spielt fast zweifellos eine entscheidende Rolle in der Gentherapieentwicklung. |