| La microscopia Atómica de la fuerza (AFM) proporciona a la capacidad de realizar mediciones tridimensionales de las estructuras superficiales en nanómetro--subangstrom a la resolución en ambientes ambiente y líquidos. Estas capacidades han llevado a las ciencias de la vida innovadoras avances en la investigación de la DNA, de las proteínas, y de las células. Particularmente, la investigación farmacéutica implica varias aplicaciones que se estén beneficiando rápidamente del AFM, como técnica independiente y como complemento potente a las otras técnicas analíticas comunes actualmente disponibles. Esta nota de aplicación examina cómo el AFM ofrece la capacidad única de la investigación directa, individual de los vehículos de salida del gen en la alta resolución en un estado hidratado. Historia y Métodos del AFM El AFM es el formulario más de uso general de la familia de la microscopia de la antena (SPM) de la exploración de técnicas. El origen de SPM comenzó con el revelado del microscopio el hacer un túnel de la exploración (STM) en 1982 por los investigadores en IBM, Zurich. La capacidad de STM de resolver la estructura atómica en una superficie de la muestra ganó a inventores el Premio Nobel En 1986. Sin Embargo, STM se puede aplicar solamente a los especímenes conductores o semiconductive. Para ensanchar este tipo de microscopia al estudio de aisladores, el microscopio atómico de la fuerza fue desarrollado en la colaboración entre IBM y la Universidad de Stanford en 1986. El AFM es realizado explorando una punta sostenida en el extremo de un voladizo flexible a través de una superficie de la muestra, mientras que mantiene una fuerza pequeña, constante (véase el Cuadro 1). 
Cuadro 1. imagen de SEM (magnificación 300X) de un silicio integrado del único cristal voladizo y de la punta con un radio del extremo de 5nm a 10nm. Las puntas tienen típicamente un radio del extremo de 5nm a 10nm, aunque ésta pueda variar dependiendo de tipo de la punta. El movimiento de la exploración conducto por un analizador piezoeléctrico del tubo que explore la punta sobre la muestra en un modelo del retículo (véase el Cuadro 2). 
Cuadro 2. Diagrama Esquemático de los componentes mayores de un microscopio atómico de la fuerza, mostrando el bucle de retroalimentación para la operación de TappingMode. TappingMode y Modo de Contacto AFM La acción recíproca de la punta-muestra es vigilada reflejando un laser del dorso del voladizo sobre un detector del hendidura-fotodiodo. El modo de operación más de uso general dos es el modo de contacto AFM y TappingMode™ AFM, que se pueden conducto en ambientes del aire y del líquido. En el modo de contacto AFM, una desviación voladiza constante es mantenida por un bucle de retroalimentación que mueva el analizador verticalmente (z) en cada lateral (X, Y) punto de referencias para formar la imagen topográfica. Manteniendo una desviación constante durante la exploración, una fuerza vertical constante se mantiene entre la punta y la muestra. Aunque el modo de contacto haya probado útil para una amplia gama de aplicaciones, no está como efectivo en muestras relativamente suaves. Por otra parte, TappingMode AFM consiste en el oscilar el voladizo en su frecuencia de la resonancia (típicamente ~300kHz) y el explorar a través de la superficie con un constante, amplitud amortiguada. El bucle de retroalimentación mantiene una amplitud constante (RMS) del rootmean-cuadrado moviendo el analizador verticalmente durante la exploración, que mantiene correspondientemente una fuerza aplicada constante para formar una imagen topográfica. La ventaja de TappingMode es que operatorio típicamente con una fuerza vertical más inferior que eso posible con modo de contacto, y elimina el lateral, las fuerzas de resistencia que pueden dañar algunas muestras. Así, TappingMode se ha convertido en la técnica preferida para las superficies suaves, frágiles, adhesivas, y de partículas de la proyección de imagen. AFM en la Investigación de la Salida del Gen La Terapia génica ha estado ganando impulso como método efectivo para tratar enfermedades genético-basadas. Sin Embargo, uno de los obstáculos primarios que hacen frente a este formulario del tratamiento está en la salida del material genético condensado a su meta prevista. Hay dos métodos comunes de pila de discos la DNA para la salida del gen: viral y nonviral. Aunque el modo viral-mediado de la salida del gen es actualmente el más común, puede ser problemático debido a la activación de la reacción inmunológica de un paciente, que puede eliminar el vehículo de salida del gen antes de usar y producir otros problemas de salud. Para evitar estas complicaciones, los vehículos nonviral fabricados fuera de los liposomas o los polímeros se están utilizando cada vez más para encapsular la DNA u otra los materiales relacionados droga. El AFM ha mejorado con éxito el revelado de tales vehículos de salida del gen proporcionando a una mayor comprensión del proceso de la condensación de la DNA. El Cuadro 3 muestra los condensados nonviral de la DNA que fueron formados con diversos lazos de la carga. 
Cuadro 3. Cuatro diversos estados condensados de DNA de un estudio de los vehículos de salida nonviral del gen: a) Negativo Condensada - cargado en NiCl2- mica tratada, b) Condensado - encargado de 0,2 milímetros NiCl, 2c) Condensado positivo - cargado negativo, d) Noncondensed. Dependiendo del mecanismo de la formación, los condensados pila de discos apretado o se desenredan ligeramente. exploraciones del 1ìm. Las Variables en el proceso de la formación dan lugar a positivo o a condensados cargados negativa, produciendo diversos grados de empaque de la DNA. El AFM ofrece una ventaja distinta sobre otros métodos para investigar los condensados de la DNA. Una de las ventajas más grandes es la capacidad del AFM de ver la estructura del vehículo de salida en su estado hidratado, pues aparecería funcionando. Además, con la resolución de la nanómetro-escala del AFM, los investigadores pueden fácilmente imagen los hilos de la DNA y ven cómo reaccionan y condensan con un polímero o un liposoma determinado. Ninguna otra técnica permite la investigación directa de vehículos individuales en la alta resolución en un estado hidratado. Por ejemplo, hay las diversas técnicas del partícula-apresto que producen una distribución dimensional sobre un gran número de condensados, pero no pueden ser aplicados a un condensado individual. Una de las técnicas mas comunes usadas actualmente es la microscopia electrónica (EM), que ofrece la alta resolución necesaria para ver los condensados individuales, pero requiere tiempo de preparación importante de la muestra y requiere el espécimen ser desecado en un ambiente del vacío. Puesto Que, la desecación de los vehículos de salida del gen puede cambiar su estructura, los resultados son, en el mejor de los casos, menos útiles. En peor de los casos, estos resultados pueden ser engañosos y resultado en vehículos de salida ineficaces del gen. Generalmente, el AFM se aplica a los vehículos de salida del gen que están en una solución. Se inyectan en la célula flúida donde asocian a un substrato, típicamente mica. Los vehículos son sujetados en la superficie de la mica por la carga. - Los condensados cargados se atraen naturalmente a la carga negativa de la superficie de la mica, y negativo - los condensados cargados se pueden atraer Positivo negativo - a la mica cargada colocando un catión bivalente en la solución, o recubriendo la mica con un silano para formar la AP-mica. La proyección de imagen del AFM entonces conducto en la solución vía la técnica de TappingMode. Sin Embargo simple prepararse y realizarse, el AFM puede así proporcionar a muy de alta resolución en los condensados individuales de la DNA. Estudios de la Salida del Gen Ha habido varios estudios AFM-basados publicados de la salida del gen. Dunlap y los compañeros de trabajo estudiaron variaciones en los mecanismos de la condensación de la DNA supercoiled 5-7kb del plásmido de largo con un lípido catiónico, lipospermine (dioctadecylamidoglycylspermine o los PERROS), y un polímero catiónico, polyethylenimine (PEI). Los condensados resultantes eran reflejados por TappingMode en la solución del NaCl 15mM. Para ambos PERROS y PEI, los bucles plegables de la DNA que irradiaban de memorias centrales eran evidentes, indicando la condensación pila de discos bucles plegables de la DNA. En el Cuadro 4, los manojos de DNA se pueden ver sin obstrucción junto con los glóbulos del polímero. Este condensado parcial ha formado una estructura toroidal del circularization de un condensado oblongo con nodos múltiples de la condensación. Variando la concentración de PERROS y de PEI, las condiciones para la condensación completa también fueron investigadas. Los condensados Completos de PEI fueron encontrados para ser 20 a 40 nanómetros de diámetro, mientras que los condensados completos de los PERROS fueron encontrados para ser 50 a 70 nanómetros. Esto sugiere que PEI pueda ser un agente de condensación más efectivo que los PERROS. La diferencia de tamaño y morfología puede también afectar a su eficiencia como agente de la transfección. 
Cuadro 4. salida del gen de Nonviral con la DNA condensada y un polímero. Los glóbulos de Orangeviolet del polyethylenimine (PEI), un polímero catiónico, los manojos circulares estabilizados de DNA de color verde amarillo colocan en un plásmido del kilobase cinco. Las moléculas Desmontadas eran reflejadas en TappingMode en la solución de sal 15mM. El AFM también se ha utilizado a los procesos dinámicos de la imagen in situ para ganar una mejor comprensión de los mecanismos de la formación asociados a la condensación de la DNA. La Condensación de polivinílico pegylated (amidoamina) con la DNA se ha observado en la solución acuosa en tiempo real. La carga positiva total del condensado polímero-DNA fue utilizada para sujetar electroestático los condensados negativo - a la mica cargada. Sin Embargo, no fue sujetado en cuanto a previene tan rígido el movimiento de los condensados durante su formación. La Proyección De Imagen de los condensados en la solución indicó la presencia de estructuras toroidales y varilla-como condensadas. En el Cuadro 5, la formación de un condensado toroidal se puede considerar sobre una duración de 35 minutos. De estas imágenes, la estructura toroidal aparece ser formada ensamblando los finales de a varilla-como el condensado. 
Cuadro 5. Formación del condensado toroidal del DNA-polímero sobre la duración minuciosa 35. Barra de la Escala = 200nm. Las Posteriores investigaciones han mostrado la existencia de varilla-como y las estructuras toroidales en un estado del equilibrio dinámico, con los condensados cambiando varilla-como de toroidal, y de toroidal varilla-como a las estructuras. Estudiar los procesos dinámicos en tiempo real permite ganar una mejor comprensión de la cinética del proceso de la condensación, que podría llevar a las mejorías importantes en salida del gen. Conclusión El AFM ha demostrado éxito en estudiar el nanoscale, estructuras ines situ de la DNA. Esto tiene una importancia obvia a los esfuerzos de desarrollar vehículos de salida más efectivos del gen. Los Investigadores están utilizando las muchas ventajas de la AFM-alta resolución, preparación simplificada de la muestra, investigación en tiempo real, proyección de imagen no destructiva, y la capacidad de realizarse hacia adentro líquido-a investiga mecanismos de la condensación de la DNA y los diversos materiales de gen-empaquetado. Aunque los ejemplos discutidos arriba sean apenas un muestreo del trabajo que ha conducto con los microscopios atómicos de la fuerza en estudios de la salida del gen, indican cómo es importante el AFM es al futuro de la terapia génica. Las ventajas únicas del AFM desempeñarán casi ciertamente un papel crucial en el revelado de la terapia génica. |