| La microscopie Atomique de force (AFM) fournit la capacité d'exécuter des mesures en trois dimensions des structures extérieures à nanomètre--subangstrom à la définition dans les environnements ambiants et liquides. Ces capacités ont abouti aux sciences de la vie d'inauguration des avances dans l'enquête sur l'ADN, les protéines, et les cellules. En particulier, la recherche pharmaceutique concerne un certain nombre d'applications qui tirent bénéfice rapidement de l'AFM, comme technique autonome et comme complément puissant aux autres techniques analytiques communes actuellement disponibles. Cette note d'application examine comment l'AFM offre la seule capacité de l'enquête directe et individuelle sur des véhicules d'accouchement de gène à la haute résolution dans une condition hydratée. Histoire et Méthodes d'AFM L'AFM est la forme la plus utilisée généralement de la famille de microscopie de sonde (SPM) de lecture des techniques. L'origine de SPM a commencé par le développement du microscope de perçage d'un tunnel de lecture (STM) en 1982 par des chercheurs à IBM, Zurich. La capacité du STM de résoudre la structure atomique sur une surface témoin a gagné aux inventeurs le Prix Nobel en 1986. Cependant, le STM peut seulement être appliqué aux spécimens conducteurs ou semiconductive. Pour élargir ce type de microscopie à l'étude des isolants, le microscope atomique de force a été développé en collaboration entre IBM et l'Université de Stanford en 1986. L'AFM est exécuté en balayant une extrémité tranchante sur l'extrémité d'un encorbellement flexible en travers d'une surface témoin, tout en mettant à jour un petit, force constante (voir le Schéma 1). 
Le Schéma 1. image de SEM (agrandissement 300X) d'un silicium intégré de monocristal en porte-à-faux et d'extrémité avec un radius d'extrémité de 5nm à 10nm. Les extrémités ont type un radius d'extrémité de 5nm à 10nm, bien que ceci puisse varier selon le type d'extrémité. Le mouvement de lecture est conduit par un balayeur piézoélectrique de tube qui balaye l'extrémité au-dessus de l'échantillon dans une configuration de trame (voir le Schéma 2). 
Le Schéma 2. Schéma des composants principaux d'un microscope atomique de force, affichant la boucle de contre-réaction pour le fonctionnement de TappingMode. TappingMode et Mode de Contact AFM L'interaction d'extrémité-échantillon est surveillée en réfléchissant un laser hors de l'arrière de l'encorbellement sur un détecteur de fractionnement-photodiode. Le mode de fonctionnement deux le plus utilisé généralement sont le mode de contact AFM et le TappingMode™ AFM, qui peuvent être conduits dans des environnements d'air et de liquide. En contact le mode AFM, un fléchissement en porte-à-faux constant est mis à jour par une boucle de contre-réaction qui déménage le balayeur verticalement (z) à chaque partie latérale (X, Y) point d'informations pour former l'image topographique. En mettant à jour un fléchissement constant pendant la lecture, une force verticale constante est mise à jour entre l'extrémité et l'échantillon. Bien Que le mode de contact ait utile prouvé pour un large éventail d'applications, il n'est pas comme pertinent sur les échantillons relativement mous. D'autre part, TappingMode AFM se compose osciller l'encorbellement à sa fréquence de résonance (type ~300kHz) et balayer en travers de la surface avec une constante, amplitude mouillée. La boucle de contre-réaction met à jour une amplitude constante (RMS) de rootmean-carré en déménageant le balayeur verticalement pendant la lecture, qui met à jour également une force appliquée constante pour former une image topographique. L'avantage de TappingMode est qu'il fonctionne type avec une force verticale inférieure que cela possible avec le mode de contact, et il élimine la partie latérale, les forces de cisaillement qui peuvent endommager quelques échantillons. Ainsi, TappingMode est devenu la technique préférée pour les surfaces molles, fragiles, adhésives, et particulaires de représentation. AFM dans la Recherche d'Accouchement de Gène La Thérapie génique s'était accélérée comme méthode efficace pour traiter les maladies génétique-basées. Cependant, un des obstacles primaires faisant face à cette forme de demande de règlement est dans l'accouchement du matériel génétique condensé à son objectif destiné. Il y a deux méthodes classiques de bourrer l'ADN pour l'accouchement de gène : viral et nonviral. Bien Que le mode viral-assisté de l'accouchement de gène soit actuel le plus commun, il peut être dû problématique au lancement de la réaction immunologique d'un patient, qui peut éliminer le véhicule d'accouchement de gène avant que produit d'utiliser-et d'autres problèmes de santé. Pour éviter ces complications, des véhicules nonviral fabriqués hors des liposomes ou les polymères de plus en plus sont utilisés pour encapsuler l'ADN ou autre les matériaux associés par médicament. L'AFM a avec succès amélioré le développement de tels véhicules d'accouchement de gène en fournissant une compréhension plus grande du procédé de la condensation d'ADN. Le Schéma 3 affiche les condensats nonviral d'ADN qui ont été formés avec différentes relations de charge. 
Le Schéma 3. Quatre conditions condensées différentes d'ADN d'une étude des véhicules d'accouchement nonviral de gène : a) Négativement Condensé - chargé sur NiCl2- mica traité, b) Condensé négativement - chargé de 0,2 millimètres NiCl2, c) Condensé franchement - chargé, d) Noncondensed. Selon le mécanisme de formation, les condensats sont fortement bourrés ou légèrement démêlés. échographies de 1ìm. Les Variables dans le procédé de formation ont comme conséquence le positif ou les condensats chargés par négatif, produisant des divers niveaux d'emballage d'ADN. L'AFM offre un avantage distinct par rapport à d'autres méthodes pour vérifier les condensats d'ADN. Un des avantages les plus grands est la capacité de l'AFM de visualiser la structure du véhicule d'accouchement dans sa condition hydratée, car il apparaîtrait en service. De plus, avec la définition de la nanomètre-échelle de l'AFM, les chercheurs mettent en boîte facilement l'image les Brins d'ADN et voient comment ils réagissent et se condensent avec du polymère ou la liposome particulier. Aucune autre technique ne permet l'enquête directe sur différents véhicules à la haute résolution dans une condition hydratée. Par exemple, il y a des techniques variées de particule-calibrage qui produisent une distribution de grandeurs au-dessus d'un très grand nombre de condensats, mais ils ne peuvent pas être appliqués à un condensat individuel. Une des techniques les plus communes actuel utilisées est une microscopie électronique (EM), qui offre la haute résolution requise pour visualiser différents condensats, mais a besoin de le temps de préparation des échantillons significatif et exige du spécimen d'être desséché dans un environnement d'aspirateur. Puisque, dessécher les véhicules d'accouchement de gène peut changer leur structure, les résultats sont, au mieux, moins utiles. Au pis aller, ces résultats peuvent être fallacieux et résultat dans des véhicules d'accouchement inutiles de gène. Généralement, l'AFM est appliqué aux véhicules d'accouchement de gène qui sont dans une solution. Ils sont injectés dans la cellule liquide où ils fixent à un substrat, type mica. Les véhicules sont retenus sur la surface de mica par la charge. Franchement - des condensats chargés sont naturellement attirés à la charge négative de la surface de mica, et négativement - des condensats chargés peuvent être attirés négativement - au mica chargé en mettant un cation bivalent dans la solution, ou en enduisant le mica d'un silane pour former l'AP-mica. La représentation d'AFM est alors conduite en solution par l'intermédiaire de la technique de TappingMode. Cependant simple pour préparer et exécuter, l'AFM peut ainsi fournir très à haute résolution sur différents condensats d'ADN. Études d'Accouchement de Gène Il y a eu un certain nombre d'études AFM-basées publiées d'accouchement de gène. Dunlap et collègues ont étudié des variations des mécanismes de condensation du plasmide supercoiled ADN 5-7kb dans la longueur avec du lipide cationique, le lipospermine (dioctadecylamidoglycylspermine ou TOCS), et un polymère cationique, le polyethylenimine (PEI). Les condensats donnants droit étaient imagés par TappingMode dans la solution de NaCl de 15mM. Pour les deux TOCS et PEI, les boucles pliées d'ADN rayonnant des noyaux centraux étaient évidentes, indiquant la condensation en bourrant les boucles pliées de l'ADN. Sur le Schéma 4, des paquets d'ADN peuvent être de manière dégagée vus avec les globules de polymère. Ce condensat partiel a formé une structure toroïdale du circularization d'un condensat oblong avec les noeuds multiples de condensation. En variant la concentration des TOCS et du PEI, les conditions pour la condensation complète ont été également vérifiées. Des condensats Complets de PEI se sont avérés 20 à 40 nanomètres de diamètre, attendu que des condensats complets de TOCS se sont avérés 50 à 70 nanomètres. Ceci suggère que PEI puisse être un agent de condensation plus pertinent que les TOCS. La différence dans la taille et la morphologie peuvent également affecter leur efficience comme agent de transfection. 
Le Schéma 4. accouchement de gène de Nonviral avec l'ADN condensé et un polymère. Les globules d'Orangeviolet du polyethylenimine (PEI), un polymère cationique, les paquets circulaires stabilisés d'ADN vert jaunâtre engage dans un plasmide de la kilobase cinq. Les molécules Défaites étaient imagées dans TappingMode dans la solution de sel de 15mM. L'AFM également a été employé aux procédés dynamiques d'image in situ pour gagner une meilleure compréhension des mécanismes de formation associés avec la condensation d'ADN. On a observé la Condensation de poly pegylated (amidoamine) avec l'ADN dans la solution aqueuse en temps réel. La charge positive générale du condensat polymère-ADN a été employée pour retenir électrostatiquement les condensats sur négativement - le mica chargé. Cependant, on ne l'a pas retenu tellement rigidement pour évitent le mouvement des condensats pendant leur formation. La Représentation des condensats a en solution indiqué la présence des structures condensat toroïdales et comme une tige. Sur le Schéma 5, la formation d'un condensat toroïdal peut être vue au-dessus d'une période de 35 mn. De ces images, la structure toroïdale semble être constituée en joignant les extrémités d'un condensat comme une tige. 
Le Schéma 5. Formation du condensat toroïdal d'ADN-polymère plus de période 35 mn. Barre d'Échelle = 200nm. Les Enquêtes postérieures ont affiché l'existence des structures comme une tige et toroïdales dans une condition d'équilibre dynamique, avec les condensats changeant d'un comme une tige en toroïdal, et toroïdal en les structures comme une tige. L'Étude des procédés dynamiques en temps réel permet pour gagner une meilleure compréhension de la cinétique du procédé de condensation, qui pourrait mener aux importantes améliorations dans l'accouchement de gène. Conclusion L'AFM a expliqué la réussite en étudiant le nanoscale, structures in situ d'ADN. Ceci a une pertinence évidente avec des efforts pour développer des véhicules d'accouchement plus pertinents de gène. Les Chercheurs emploient les nombreux avantages de la définition d'AFM-haut, préparation des échantillons simplifiée, enquête en temps réel, représentation non destructive, et la capacité d'exécuter dedans liquide-à vérifient des mécanismes de condensation d'ADN et des matériaux variés de gène-emballage. Bien Que les exemples discutés ci-dessus soient juste un échantillonnage du travail qui a été conduit avec les microscopes atomiques de force dans des études d'accouchement de gène, ils indiquent combien important l'AFM a lieu au contrat à terme de la thérapie génique. Les seuls avantages de l'AFM joueront presque certainement un rôle essentiel dans le développement de thérapie génique. |