| La microscopia Atomica della forza (AFM) fornisce la capacità di realizzare le misure tridimensionali delle strutture di superficie nanometro--subangstro'a risoluzione negli ambienti ambientali e liquidi. Queste capacità piombo alle scienze biologiche dirottura gli avanzamenti nell'indagine su DNA, su proteine e sulle celle. In particolare, la ricerca farmaceutica comprende una serie di applicazioni che stanno traendo giovamento rapido dal AFM, sia come tecnica autonoma che come complemento potente alle altre tecniche analitiche comuni attualmente disponibili. Questa nota di applicazione esamina come il AFM offre la capacità unica di indagine diretta e determinata sui vettori del gene all'alta risoluzione in uno stato idratato. Cronologia e Metodi del AFM Il AFM è il modulo più comunemente usato della famiglia di microscopia della sonda (SPM) di scansione delle tecniche. L'origine di SPM ha cominciato con lo sviluppo del microscopio di traforo di scansione (STM) nel 1982 dai ricercatori ad IBM, Zurigo. La capacità di STM di risolvere la struttura atomica su una superficie del campione utile agli inventori il Premio Nobel nel 1986. Tuttavia, STM può applicarsi soltanto agli esemplari conduttivi o semiconductive. Per estendere questo tipo di microscopia allo studio degli isolanti, il microscopio atomico della forza è stato sviluppato nella collaborazione fra IBM e la Stanford University nel 1986. Il AFM è eseguito scandendo un suggerimento marcato sull'estremità di una trave a mensola flessibile attraverso una superficie del campione, mentre mantiene una piccola, forza costante (si veda Figura 1). 
Figura 1. immagine di SEM (ingrandimento 300X) di un silicio monocristallino integrato a mensola e del suggerimento con un raggio dell'estremità di 5nm a 10nm. I suggerimenti hanno tipicamente un raggio dell'estremità di 5nm a 10nm, sebbene questo possa variare secondo il tipo del suggerimento. Il moto di scansione è condotto da uno scanner piezoelettrico del tubo che scandisce il ribaltare il campione in un reticolo del quadro televisivo (si veda Figura 2). 
Figura 2. Disegno Schematico delle componenti principali di un microscopio atomico della forza, mostranti il ciclo di feedback per l'operazione di TappingMode. TappingMode e Modo di Contatto AFM L'interazione del suggerimento-campione è riflessa riflettendo un laser fuori dalla parte posteriore della trave a mensola su un rivelatore del spaccatura-fotodiodo. Il modo di funzionamento più comunemente usato due è il modo di contatto AFM e TappingMode™ AFM, che possono essere condotti sia negli ambienti del liquido che dell'aria. Nel modo di contatto AFM, una deformazione a mensola costante è mantenuta da un ciclo di feedback che muove verticalmente lo scanner (z) ad ogni laterale (X, Y) punto di informazioni per formare l'immagine topografica. Mantenendo una deformazione costante durante lo scansione, una forza verticale costante è mantenuta fra il suggerimento ed il campione. Sebbene il modo di contatto abbia provato utile per una vasta gamma di applicazioni, non è come efficace sui campioni relativamente molli. D'altra parte, TappingMode AFM consiste di oscillare la trave a mensola alla sua frequenza di risonanza (tipicamente ~300kHz) e scandire attraverso la superficie con una costante, ampiezza ammortizzata. Il ciclo di feedback mantiene un'ampiezza costante (RMS) del rootmean-quadrato muovendo lo scanner verticalmente durante lo scansione, che mantiene corrispondentemente una forza applicata costante per formare un'immagine topografica. Il vantaggio di TappingMode è che funziona tipicamente con una forza verticale più bassa che quello possibile con il modo di contatto ed elimina la laterale, forze di taglio che possono danneggiare alcuni campioni. Quindi, TappingMode si è trasformato nella tecnica preferita per le superfici molli, fragili, adesive e polverizzate della rappresentazione. AFM nella Ricerca di Consegna del Gene La Terapia genica sta guadagnando lo slancio come efficace metodo per il trattamento delle malattie basate a genetica. Tuttavia, uno degli ostacoli primari che affrontano questo modulo del trattamento è nella consegna del materiale genetico condensato al suo obiettivo progettato. Ci sono due metodi comuni di imballaggio del DNA per la consegna del gene: virale e nonviral. Sebbene il modo virale-mediato di consegna del gene sia corrente il più comune, può essere problematico dovuto l'attivazione della risposta immunologica di un paziente, che può eliminare il vettore del gene prima dell'uso e produrre altri problemi sanitari. Per evitare queste complicazioni, i veicoli nonviral da costruzione dai liposomi o i polimeri sempre più stanno utilizzandi per incapsulare il DNA o altro materiali riferiti droga. Il AFM ha migliorato con successo lo sviluppo di tali vettori del gene fornendo una maggior comprensione del trattamento di condensazione del DNA. Figura 3 mostra i condensati nonviral del DNA che sono stati formati con differenti relazioni della tassa. 
Figura 3. Quattro stati condensati differenti di DNA da uno studio dei vettori nonviral del gene: a) - Fatto pagare su NiCl - mica2trattata negativamente Condensata, b) Condensato - incaricato di 0,2 millimetri NiCl, 2c) Condensato positivamente - fatto pagare negativamente, d) Noncondensed. Secondo il meccanismo di formazione, i condensati sono imballati strettamente o leggermente sono disfatti. scansioni di 1ìm. Le Variabili nel trattamento di formazione provocano il positivo o condensati fatti pagare quantità negativa, producendo i vari livelli di imballaggio del DNA. Il AFM offre un vantaggio distinto sopra altri metodi per lo studio dei condensati del DNA. Uno di più grandi vantaggi è la capacità del AFM di osservare la struttura del vettore nel suo stato idratato, poichè comparirebbe in uso. Inoltre, con risoluzione del nanometro-disgaggio del AFM, i ricercatori inscatolano facilmente l'immagine i fili del DNA e vedono come reagiscono e condensano con un polimero o un liposoma particolare. Nessuna altra tecnica permette l'indagine diretta sui diversi veicoli all'alta risoluzione in uno stato idratato. Per esempio, ci sono varie tecniche dell'particella-incollatura che producono una distribuzione per ampiezza sopra un grandissimo numero di condensati, ma non possono applicarsi ad un condensato determinato. Una delle tecniche più comuni corrente usate è microscopia elettronica (EM), che offre l'alta risoluzione stata necessaria per osservare i diversi condensati, ma richiede il tempo di preparato significativo del campione e richiede l'esemplare di essere asciugata in un ambiente di vuoto. Poiché, asciugare i vettori del gene può cambiare la loro struttura, i risultati sono, nel migliore dei casi, meno utili. Nel peggiore dei casi, questi risultati possono essere ingannevoli e risultato in vettori inefficaci del gene. Generalmente, il AFM si applica ai vettori del gene che sono in una soluzione. Sono iniettati nella cella fluida in cui fissano ad un substrato, tipicamente mica. I veicoli sono tenuti sulla superficie della mica dalla tassa. - I condensati fatti pagare sono attirati naturalmente verso la carica negativa della superficie della mica e negativamente - i condensati fatti pagare possono essere attirati Positivamente negativamente verso - la mica fatta pagare collocando un catione bivalente nella soluzione, o ricoprendo la mica di silano per formare la AP-mica. La rappresentazione del AFM poi è condotta in soluzione via la tecnica di TappingMode. Comunque semplice preparare ed eseguire, il AFM può così fornire molto ad alta definizione sui diversi condensati del DNA. Studi di Consegna del Gene Ci sono stati una serie di studi AFM basati pubblicati della consegna del gene. Dunlap ed i colleghe hanno studiato le variazioni nei meccanismi di condensazione del DNA 5-7kb supercoiled del plasmide di lunghezza con un lipido cationico, il lipospermine (dioctadecylamidoglycylspermine o CANI) e un polimero cationico, polyethylenimine (PEI). I condensati risultanti erano imaged da TappingMode nella soluzione del NaCl di 15mM. Per entrambi i CANI e PEI, i cicli profilatura del DNA che si irradiano dalle anime erano evidenti, indicando la condensazione imballando i cicli profilatura di DNA. Nella Figura 4, i gruppi di DNA possono essere veduti chiaramente con i globuli del polimero. Questo condensato parziale ha formato una struttura toroidale dal circularization di un condensato oblungo con i vertici multipli di condensazione. Variando la concentrazione di CANI e di PEI, i termini per condensazione completa egualmente sono stati studiati. I condensati Completi di PEI sono stati trovati per essere 20 - 40 nanometri di diametro, mentre i condensati completi dei CANI sono stati trovati per essere 50 - 70 nanometri. Ciò suggerisce che PEI possa essere un agente di condensazione più efficace che i CANI. La differenza nella dimensione e nella morfologia può anche pregiudicare il loro risparmio di temi come agente di transfezione. 
Figura 4. consegna del gene di Nonviral con DNA condensato e un polimero. I globuli di Orangeviolet del polyethylenimine (PEI), un polimero cationico, gruppi circolari stabilizzati di DNA giallo verde avvolge in un plasmide di kilobase cinque. Le molecole Slegate erano imaged in TappingMode nella soluzione salina di 15mM. Il AFM egualmente è stato usato ai trattamenti dinamici di immagine in situ per guadagnare una migliore comprensione dei meccanismi di formazione connessi con condensazione del DNA. La Condensazione di poli pegylated (amidoammina) con DNA è stata osservata nella soluzione acquosa in tempo reale. La carica positiva globale del condensato polimero-DNA è stata usata per tenere elettrostaticamente negativamente i condensati - alla mica fatta pagare. Tuttavia, non è stato tenuto così rigidamente quanto a impedisce il movimento dei condensati durante la loro formazione. La Rappresentazione dei condensati in soluzione ha indicato la presenza di strutture condensate toroidali e bastoncine bastoncino. Nella Figura 5, la formazione di condensato toroidale può essere ispezionata un periodo di 35 minuti. Da queste immagini, la struttura toroidale sembra essere costituita dall'aggiunta delle estremità di un condensato bastoncino bastoncino. 
Figura 5. Formazione del condensato toroidale del DNA-polimero oltre periodo minuto 35. Barra del Disgaggio = 200nm. Le Indagini successive hanno indicato l'esistenza delle strutture bastoncine bastoncino e toroidali in uno stato di equilibrio dinamico, con i condensati che cambiano da bastoncino bastoncino a toroidale ed a toroidale alle strutture bastoncine bastoncino. Lo Studio dei trattamenti dinamici in tempo reale permette di guadagnare una migliore comprensione della cinetica del trattamento di condensazione, in grado di piombo ai miglioramenti significativi nella consegna del gene. Conclusione Il AFM ha dimostrato il successo nello studio del nanoscale, strutture in situ del DNA. Ciò ha una pertinenza ovvia con sforzi per sviluppare i vettori più efficaci del gene. I Ricercatori stanno utilizzando i molti vantaggi di risoluzione AFM alta, preparato semplificato del campione, ricerca in tempo reale, la rappresentazione non distruttiva e la capacità di eseguire dentro liquido-a studia i meccanismi di condensazione del DNA ed i vari materiali d'imballaggio. Sebbene gli esempi discussi sopra siano appena una campionatura del lavoro che è stato condotto con i microscopi atomici della forza negli studi della consegna del gene, indicano quanto importante il AFM ha luogo al futuro di terapia genica. I vantaggi unici del AFM quasi certamente svolgeranno un ruolo cruciale nello sviluppo di terapia genica. |