| 原子力の顕微鏡検査は (AFM)包囲された、液体の環境で解像度ナノメーターにsubangstrom で表面の構造の三次元測定を行う機能を提供します。 これらの機能は開発中の生命科学に DNA、蛋白質およびセルの調査の前進を導きました。 特に、薬剤の研究はスタンドアロン技術と現在利用できる他の共通の解析技法に強力な補数として AFM から急速に、寄与しているいくつかのアプリケーションを含みます。 このアプリケーションノートは AFM が水和させた状態の高リゾリューションで遺伝子配達手段の直接の、個々の調査の一義的な機能をどのように提供するか検査します。 AFM 歴史および方法 AFM は技術のスキャンのプローブの顕微鏡検査の系列の (SPM)最も広く使われた形式です。 SPM の起源は IBM、チューリッヒで研究者によって 1982 年に (STM)スキャンのトンネルを掘る顕微鏡の開発から始まりました。 STM の機能はサンプル表面の原子構造を解決する発明家に 1986 年にノーベル賞を得ました。 ただし、 STM は伝導性か semiconductive 標本にしか適用することができません。 絶縁体の調査にこのタイプの顕微鏡検査を広げるためには、原子力の顕微鏡は 1986 年に IBM とスタンフォード大学間の共同で発達しました。 AFM はによって小さいスキャン、一定した力を維持している間サンプル表面を渡る適用範囲が広い片持梁の端の鋭い先端の行われます、 (図 1) を見て下さい。 
図 1. および 5nm に 10nm の端の半径との先端片持梁統合された単結晶のケイ素の SEM の画像 (300X 拡大)。 これが先端のタイプによって変わることができるが、先端に普通 5nm に 10nm の端の半径があります。 スキャンの動きはラスターパターンのサンプル上の先端をスキャンする圧電気の管のスキャンナーによって行なわれます (図 2) を見て下さい。 
TappingMode 操作のためのフィードバックループを示す原子力の顕微鏡の主要コンポーネントの図 2. 設計図。 TappingMode および接触モード AFM 先端サンプル相互作用は分割フォトダイオード探知器に片持梁の背部を離れてレーザーの反映によって監察されます。 2 最も広く使われた動作モードは空気および液体両方環境で行なうことができる TappingMode™ AFM です、および接触モード AFM。 接触モード AFM では、一定した片持梁偏向は各側面 (X、 Y) 地勢画像をでスキャンナー (z) を形作るデータ点縦に移動するフィードバックループによって維持されます。 スキャンの間の一定した偏向の維持によって、一定した縦力は先端とサンプルの間で維持されます。 接触モードは広い応用範囲のための有用証明したが、比較的柔らかいサンプルで有効ようにありません。 一方では、 TappingMode AFM は共鳴頻度 (普通 ~300kHz) の振動し、定数、弱められた振幅の表面を渡ってスキャンから片持梁成っています。 フィードバックループは地勢画像を形作るために (RMS)相応じて一定した応用力を維持するスキャンの間にスキャンナーを縦に移動することによって一定した rootmean 正方形の振幅を維持します。 TappingMode の利点は接触モードと可能なそれより低い縦力と普通動作する側面、あるサンプルを傷つけることができるせん断力を除去しますことであり。 従って、 TappingMode はイメージ投射柔らかく、壊れやすく、付着力の、微粒子の表面のための好まれた技術になりました。 遺伝子配達研究の AFM 遺伝子療法はずっと遺伝ベースの病気を扱うための有効な方法として運動量を得ています。 ただし、処置のこの形式に直面する意図されていたターゲットに凝縮させた遺伝物質の配達に一次障害の 1 つはあります。 遺伝子配達のための DNA を詰める 2 つの共通方法があります: ウイルスおよび nonviral。 遺伝子配達のウイルス仲介されたモードは現在共通であるけれども、使用の前に遺伝子配達手段を除去し、他の健康上の問題を作り出すかもしれない患者の免疫学応答のアクティブ化が問題となる原因である場合もあります。 これらの複雑化を避けるためには、 liposomes から製造される nonviral 手段がかポリマーはますます DNA または他をカプセル化するのに薬剤関連材料使用されています。 AFM は DNA の凝縮のプロセスのより大きい理解の提供によって正常にそのような遺伝子配達手段の開発を改善しました。 図 3 は異なった料金関係と形作られた nonviral DNA の凝縮物を示します。 
図 3。 nonviral 遺伝子配達手段の調査からの DNA の 4 つの凝縮させた状態: a) NiCl - 扱われた雲母2の凝縮させた負荷電、 b) 0.2 mM NiCl との凝縮させた負荷電2、 c) 凝縮させた正荷電、 d) Noncondensed。 形成メカニズムによって、凝縮物は堅く詰まるか、またはわずかに解かれます。 1ìm スキャン。 形成プロセスの変数は満たされた凝縮物でプラスでもマイナスでも起因しま、 DNA のパッキングのさまざまなレベルを作り出します。 AFM は DNA の凝縮物を調査するための他の方法上の個別の利点があります。 最も大きい利点の 1 つは使用中だったようであろうので水和させた状態の配達手段の構造を見る AFM の能力です。 さらに、 AFM のナノメータースケールの解像度と、研究者は画像を DNA の繊維容易に缶詰にし、どのように特定ポリマーか liposome と反応し、凝縮するか見ます。 他の技術は水和させた状態の高リゾリューションで個々の手段の直接調査を可能にしません。 例えば、非常に多くの凝縮物上のサイズ分布を作り出す、それらは個々の凝縮物に加えることができませんさまざまな粒子サイジングの技術があります。 現在使用される共通の技術の 1 つは個々の (EM)凝縮物を見るのに必要とされる高リゾリューションを提供するがで重要なサンプル準備時間を必要とし、そして標本を真空の環境で完全に乾くように要求します電子顕微鏡検査。 、遺伝子配達手段を完全に乾かすことが構造を変更するかもしれないので結果は、精々、より少なく有用です。 万一のことがあっても、これらの結果は非効果的な遺伝子配達手段の紛らわしく、結果であるかもしれません。 通常、 AFM は解決にある遺伝子配達手段に加えられます。 それらは基板に接続する流動セル、普通雲母に注入されます。 手段は料金によって雲母の表面で保持されます。 正荷電の凝縮物は雲母の表面の負電荷に自然に引き付けられ、負荷電の凝縮物は負荷電の雲母に解決に二価陽イオンを置くこと、または AP 雲母を形作るためにシランと雲母に塗ることによって引き付けることができます。 AFM イメージ投射は TappingMode の技術によって解決でそれから行なわれます。 準備し、行いしかしやすい AFM は個々の DNA の凝縮物で非常に高解像を提供こうしてできます。 遺伝子配達調査 いくつかの出版された AFM ベースの遺伝子配達調査がずっとあります。 Dunlap および協力者はカチオンの脂質、 lipospermine (dioctadecylamidoglycylspermine か犬)、およびカチオンポリマー、 polyethylenimine (PEI) が付いている supercoiled プラスミッド DNA 5-7kb の凝縮のメカニズムの変化を長さに調査しました。 生じる凝縮物は 15mM NaCl の解決の TappingMode によって視覚化されていました。 両方の犬および PEI のために、中核から射出する折られた DNA のループは明白で、凝縮を DNA の折られたループのパッキングによって明記します。 図 4 では、 DNA の束はポリマー小滴と共にはっきり見ることができます。 この部分的な凝縮物は多重凝縮ノードの細長い凝縮物の circularization からの円環形状の構造を形作りました。 犬および PEI の集中の変化によって、完全な凝縮のための条件はまた調査されました。 完全な PEI の凝縮物は直径の 20 完全な犬の凝縮物が 50 から 70 ナノメーターであると見つけられた一方から 40 ナノメーターであると見つけられました。 これは PEI が犬より有効な凝縮エージェントであるかもしれないことを提案します。 相違および形態はまたトランスフェクションのエージェントとして効率に影響を与えるかもしれません。 
凝縮させた DNA およびポリマーとの図 4. Nonviral の遺伝子配達。 polyethylenimine (PEI) の Orangeviolet の小滴は、カチオンポリマー 5 kilobase のプラスミッドで、黄色緑の DNA の安定させた円の束ループします。 取りはずされた分子は 15mM の塩水濃度の TappingMode で視覚化されていました。 画像の動的過程にまた AFM が DNA の凝縮と関連付けられる形成メカニズムのよりよい理解を得るのにそのままで使用されていました。 DNA との pegylated 多の凝縮は (amidoamine) リアルタイムの水溶液で観察されました。 ポリマー DNA 凝縮物の全面的な正電荷が静電気的に負荷電の雲母に凝縮物を保持するのに使用されました。 ただし、それは形成の間にそう堅くに関して防ぎます凝縮物の動きを保持されませんでした。 解決の凝縮物のイメージ投射は円環形状および棒そっくりの凝縮物の構造の存在を明記しました。 図 5 では、円環形状の凝縮物の形成は 35 分の時間に見ることができます。 これらの画像から、円環形状の構造は棒そっくりの凝縮物の端の結合によって形作られるようです。 
35 微細な時間にわたる円環形状 DNA ポリマー凝縮物の図 5. 形成。 スケール棒 = 200nm。 より詳しい調査は棒そっくりにから円環形状および円環形状棒そっくりの構造に変更していて凝縮物がダイナミックな平衡の状態で棒そっくりおよび円環形状の構造の存在を、示しました。 リアルタイムの動的過程を調査することは遺伝子配達の重要な改善の原因となることができる凝縮プロセスの動力学のよりよい理解を得ることを可能にします。 結論 AFM は nanoscale、そのままの DNA の構造の調査の成功を示しました。 これにより有効な遺伝子配達手段を発達させるための努力への明らかな検索能力があります。 研究者は AFM の高さの解像度、簡単サンプル準備、リアルタイムの調査、非破壊的なイメージ投射の多くの利点を利用して、液体に行う機能は DNA の凝縮のメカニズムおよびさまざまな遺伝子包装材料を調査します。 上で論議される例が遺伝子配達調査の原子力の顕微鏡によって行なわれた作業のちょうどサンプリングであるが、重要 AFM が遺伝子療法の未来にどのようにあるか明記します。 AFM の一義的な利点はほとんど確かに遺伝子療法の開発の重大な役割を担います。 |