| De Atoom krachtmicroscopie (AFM) verstrekt de capaciteit om uit te voeren driedimensionele metingen van oppervlaktestructuren bij nanometer-aan resolutie in omringende en vloeibare milieu's. Deze mogelijkheden hebben geleid tot grond-brekende de vooruitgang van het levenswetenschappen in het onderzoek van DNA, proteïnen, en cellen. In het bijzonder, impliceert het farmaceutische onderzoek een aantal toepassingen die snel van AFM profiteren, zowel als standalone techniek als als krachtige aanvulling aan de andere gemeenschappelijke analytische nu verkrijgbare technieken. Deze toepassingsnota onderzoekt hoe AFM het unieke vermogen van direct, individueel onderzoek van de voertuigen van de genlevering bij hoge resolutie in een gehydrateerde staat aanbiedt. Geschiedenis AFM en Methodes AFM is de het meest meestal gebruikte vorm van de de microscopiefamilie van de aftasten (SPM)sonde van technieken. De oorsprong van SPM begon met de ontwikkeling van de aftasten een tunnel gravende microscoop (STM) in 1982 door onderzoekers in IBM, Zürich. De capaciteit van STM om atoomstructuur op een steekproefoppervlakte op te lossen verdiende de uitvinders de Nobelprijs in 1986. Nochtans, kan STM slechts op geleidende of semiconductive specimens worden toegepast. Om dit type van de microscopie aan de studie van isolatie te verbreden, werd de atoomkrachtmicroscoop ontwikkeld in samenwerking tussen IBM en de Universiteit van Stanford in 1986. AFM wordt uitgevoerd door een scherp uiteinde op het eind van een flexibele cantilever over een steekproefoppervlakte af te tasten, terwijl het handhaven van een kleine, constante kracht (zie Figuur 1). 
Figuur 1. Het beeld van SEM (300X vergroting) van een geïntegreerd cantilever en een uiteinde van het enig kristalsilicium met een eindstraal van 5nm tot 10nm. De uiteinden hebben typisch een eindstraal van 5nm tot 10nm, hoewel dit afhankelijk van uiteindetype kan variëren. De aftastenmotie wordt geleid door een piezoelectric buisscanner die het uiteinde over de steekproef in een roosterpatroon (zie Figuur 2) aftast. 
Figuur 2. Het Schema van de belangrijkste componenten van een atoomkrachtmicroscoop, tonen koppelt lijn voor verrichting TappingMode terug. TappingMode en de Wijze AFM van het Contact Wordt de uiteinde-steekproef interactie gecontroleerd door een op laser van de rug van de cantilever op een spleet-fotodiode detector te wijzen. Het meest meestal gebruikte wijze twee van verrichting is contactwijze AFM en TappingMode™ AFM, die in zowel lucht als vloeibare milieu's kunnen worden geleid. Op contactwijze AFM, wordt een constante cantileverafbuiging gehandhaafd door terugkoppelt lijn die verticaal de scanner (z) op elk zij (X, Y) gegevenspunt beweegt om het topografische beeld te vormen. Door een constante afbuiging tijdens aftasten te handhaven, wordt een constante verticale kracht gehandhaafd tussen het uiteinde en de steekproef. Hoewel de contactwijze voor een brede waaier van toepassingen nuttig is gebleken, is het niet efficiënt op vrij zachte steekproeven. Anderzijds, bestaat TappingMode AFM uit het oscilleren van de cantilever bij zijn resonantiefrequentie (typisch ~300kHz) en het aftasten over de oppervlakte met een constante, getemperde omvang. Koppel lijn terug handhaaft een constante rootmean-vierkante (RMS) omvang door de scanner tijdens aftasten verticaal te bewegen, dat navenant een constante toegepaste kracht handhaaft om een topografisch beeld te vormen. Het voordeel van TappingMode is dat het typisch met een lagere verticale kracht dan dat mogelijk met contactwijze werkt, en het elimineert de zijde, scheerbeurtkrachten die sommige steekproeven kunnen beschadigen. Aldus, is TappingMode de aangewezen techniek voor weergave zachte, breekbare, zelfklevende, en corpusculaire oppervlakten geworden. AFM in het Onderzoek van de Levering van het Gen De therapie van het Gen heeft impuls als efficiënte methode bereikt om genetisch-gebaseerde ziekten te behandelen. Nochtans, is één van de primaire hindernissen die deze vorm van behandeling onder ogen zien in de levering van het gecondenseerde genetische materiaal aan zijn voorgenomen doel. Er zijn twee gemeenschappelijke methodes om DNA voor genlevering in te pakken: viraal en nonviral. Hoewel de viraal-bemiddelde wijze van genlevering momenteel het gemeenschappelijkst is, kan het problematische toe te schrijven aan de activering van de immunologische reactie van een patiënt zijn, die het voertuig van de genlevering kan v3o3or gebruik elimineren en andere gezondheidsproblemen veroorzaken. Om deze complicaties te vermijden, worden de nonviral voertuigen die uit liposomes worden vervaardigd of de polymeren meer en meer gebruikt om DNA of andere drug verwante materialen in te kapselen. AFM heeft met succes de ontwikkeling van dergelijke voertuigen van de genlevering door een beter inzicht in het proces van de condensatie van DNA te verstrekken verbeterd. Figuur 3 toont de nonviral condensaten van DNA die met verschillende lastenverhoudingen werden gevormd. 
Figuur 3. Vier verschillende gecondenseerde staten van DNA van een studie van de nonviral voertuigen van de genlevering: a) Gecondenseerd negatief - geladen op NiCl2- behandeld mica, Gecondenseerde B) - belast met 0.2 mm NiCl, 2positief Gecondenseerd c) - negatief geladen, D) Noncondensed. Afhankelijk van het vormingsmechanisme, worden de condensaten strak ingepakt of lichtjes ontrafeld. 1ìm aftasten. De Variabelen in het vormingsproces resulteren in of positieve of negatieve geladen condensaten, veroorzakend variërende graden van de verpakking van DNA. AFM biedt een verschillend voordeel over andere methodes om de condensaten van DNA aan te onderzoeken. Één van de grootste voordelen is de capaciteit van AFM om de structuur van het leveringsvoertuig in zijn gehydrateerde staat te bekijken, aangezien het in gebruik zou verschijnen. Bovendien met Afm nanometer--schaal resolutie, kunnen de onderzoekers gemakkelijk beeld de bundels van DNA en zien hoe zij reageren en met een bepaalde polymeer of liposome condenseren. Geen andere techniek staat direct onderzoek van individuele voertuigen bij hoge resolutie in een gehydrateerde staat toe. Bijvoorbeeld, zijn er divers deeltje-rangschikkend technieken die een groottedistributie meer dan een zeer groot aantal condensaten veroorzaken, maar zij kunnen niet op een individueel condensaat worden toegepast. Één van de gemeenschappelijkste momenteel gebruikte technieken is elektronenmicroscopie (EM), die de hoge resolutie nodig aanbiedt om individuele condensaten te bekijken, maar vereist de significante tijd van de steekproefvoorbereiding en vereist dat het specimen worden uitgedroogd in een vacuümmilieu. Aangezien, het uitdrogen van de voertuigen van de genlevering hun structuur kan veranderen, zijn de resultaten, in het gunstigste geval minder nuttig. In het slechtste geval, kunnen deze resultaten zijn misleidend en in de ondoeltreffende voertuigen van de genlevering resulteren. Over Het Algemeen, wordt AFM toegepast op de voertuigen van de genlevering die in een oplossing zijn. Zij worden ingespoten in de vloeibare cel waar zij aan een substraat, typisch mica vastmaken. De voertuigen worden gehouden op de micaoppervlakte door last. Positief - de geladen condensaten worden natuurlijk aangetrokken naar de negatieve last van de micaoppervlakte, en negatief - de geladen condensaten kunnen naar worden aangetrokken negatief - geladen mica door of een tweewaardig kation in de oplossing te plaatsen, of door het mica met een silaan met een laag te bedekken om AP-Mica te vormen. De weergave AFM wordt dan geleid in oplossing via de techniek TappingMode. Niettemin eenvoudig voorbereidingen te treffen en te presteren, kan AFM zo zeer high-resolution op de individuele condensaten van DNA verstrekken. De Studies van de Levering van het Gen Er zijn een aantal gepubliceerde op AFM-Gebaseerde studies van de genlevering geweest. Dunlap en de medewerkers bestudeerden variaties in de condensatiemechanismen van supercoiled plasmideDNA 5-7kb in lengte met een lipide van kationen, lipospermine (dioctadecylamidoglycylspermine of HONDEN), en een polymeer van kationen, polyethylenimine (PEI). De resulterende condensaten waren imaged door TappingMode in 15mM de oplossing van NaCl. Voor zowel HONDEN als PEI, waren de gevouwen lijnen die van DNA van centrale kernen uitstralen duidelijk, vouwde het wijzen van op condensatie door verpakking lijnen van DNA. In Figuur 4, kunnen de bundels van DNA duidelijk samen met de polymeerdruppeltjes worden gezien. Dit gedeeltelijke condensaat heeft een toroidal structuur van circularization van een langwerpig condensaat met veelvoudige condensatieknopen gevormd. Door de concentratie van HONDEN en PEI te variëren, werden de voorwaarden voor volledige condensatie ook onderzocht. De Volledige condensaten PEI werden gevonden om 20 tot 40 nanometers in diameter te zijn, terwijl de volledige condensaten van HONDEN om 50 tot 70 nanometers werden gevonden te zijn. Dit stelt voor dat PEI een efficiëntere condenserende agent kan zijn dan de HONDEN. Het verschil in grootte en de morfologie kan hun efficiency als transfectieagent ook beïnvloeden. 
Figuur 4. Het genlevering van Nonviral met gecondenseerde DNA en een polymeer. Druppeltjes van Orangeviolet van polyethylenimine (PEI), een polymeer van kationen, stabiliseerden cirkelbundels van de geelgroene lijnen van DNA in een kilobase vijf plasmide. De Losgemaakte molecules waren imaged in TappingMode in 15mM zoute oplossing. AFM is ook gebruikt aan beeld dynamische processen in situ om beter inzicht van de vormingsmechanismen te verkrijgen verbonden aan de condensatie van DNA. De Condensatie van pegylated poly (amidoamine) met DNA is waargenomen in oplossing in water in real time. De algemene positieve last van het condensaat polymeer-DNA werd gebruikt om de condensaten aan negatief elektrostatisch te houden - geladen mica. Nochtans, werd het gehouden zo stijf om geen beweging te verhinderen van de condensaten tijdens hun vorming. De Weergave van de condensaten in oplossing wees op de aanwezigheid van toroidal en staaf-als gecondenseerde structuren. In Figuur 5, kan de vorming van een toroidal condensaat over timespan van 35 minuten worden gezien. Van deze beelden, schijnt de toroidal structuur om door zich de bij einden van een staaf-als condensaat worden gevormd aan te sluiten. 
Figuur 5. Vorming van toroidal DNA-Polymeer condensaat meer dan minieme periode 35. De bar van de Schaal = 200nm. De Verdere onderzoeken hebben het bestaan van staaf-als en toroidal structuren in een staat van dynamisch evenwicht getoond, met de condensaten die van staaf-als tot toroidal veranderen, en toroidal aan staaf-als structuren. Het Bestuderen van de dynamische processen in real time maakt het mogelijk om beter inzicht van de kinetica van het condensatieproces te verkrijgen, dat tot significante verbeteringen van genlevering kon leiden. Conclusie AFM heeft succes in het bestuderen nanoscale, structuren de in situ van DNA aangetoond. Dit heeft een duidelijke relevantie voor inspanningen om de efficiëntere voertuigen van de genlevering te ontwikkelen. De Onderzoekers gebruiken de vele voordelen van AFM-Hoge resolutie, vereenvoudigde steekproefvoorbereiding, onderzoek in real time, niet destructieve weergave, en de capaciteit binnen presteren vloeibaar-om de condensatiemechanismen van DNA en diverse gen-verpakkende materialen te onderzoeken. Hoewel de hierboven besproken voorbeelden enkel een bemonstering van het werk zijn dat met atoomkrachtmicroscopen in de studies van de genlevering is geleid, wijzen zij erop hoe belangrijk AFM aan de toekomst van gentherapie is. De unieke voordelen van AFM zullen bijna zeker een essentiële rol in de ontwikkeling van de gentherapie spelen. |