| A microscopia Atômica da força (AFM) fornece a capacidade para executar medidas tridimensionais das estruturas de superfície nanômetro--subangstrom à definição em ambientes ambientais e líquidos. Estas capacidades conduziram às ciências da vida inovadores avanços na investigação do ADN, das proteínas, e das pilhas. Em particular, a pesquisa farmacêutica envolve um número de aplicações que estão tirando proveito ràpida do AFM, como uma técnica autônoma e como um complemento poderoso às outras técnicas analíticas comuns actualmente disponíveis. Esta nota de aplicação examina como o AFM oferece a capacidade original da investigação directa, individual de veículos de entrega do gene na alta resolução em um estado hidratado. História e Métodos do AFM O AFM é o formulário o mais de uso geral da família da microscopia da ponta de prova (SPM) da exploração das técnicas. A origem de SPM começou com a revelação do microscópio da escavação de um túnel da exploração (STM) em 1982 por pesquisadores no IBM, Zurique. A capacidade de STM para resolver a estrutura atômica em uma superfície da amostra ganhou aos inventores o Prémio Nobel em 1986. Contudo, STM pode somente ser aplicado aos espécimes condutores ou semiconductive. Para alargar este tipo de microscopia ao estudo dos isoladores, o microscópio atômico da força foi desenvolvido na colaboração entre o IBM e a Universidade de Stanford em 1986. O AFM é executado fazendo a varredura uma ponta afiada na extremidade de um modilhão flexível através de uma superfície da amostra, ao manter uma força pequena, constante (veja Figura 1). 
Figura 1. imagem de SEM (ampliação 300X) de um modilhão e de uma ponta integrados do silicone do único cristal com um raio da extremidade de 5nm a 10nm. As pontas têm tipicamente um raio da extremidade de 5nm a 10nm, embora esta possa variar segundo o tipo da ponta. O movimento da exploração é conduzido por um varredor piezoeléctrico da câmara de ar que faça a varredura da ponta sobre a amostra em um teste padrão da quadriculação (veja Figura 2). 
Figura 2. Diagrama Esquemático dos componentes principais de um microscópio atômico da força, mostrando o laço de feedback para a operação de TappingMode. TappingMode e Modo de Contacto AFM A interacção da ponta-amostra é monitorada refletindo um laser fora da parte traseira do modilhão em um detector do separação-fotodiodo. O modo dois o mais de uso geral de operação é o modo de contacto AFM e o TappingMode™ AFM, que podem ser conduzidos em ambientes do ar e do líquido. No modo de contacto AFM, uma deflexão constante do modilhão é mantida por um laço de feedback que mova o varredor verticalmente (Z) em cada lateral (X, Y) ponto de dados para formar a imagem topográfica. Mantendo uma deflexão constante durante a exploração, uma força vertical constante é mantida entre a ponta e a amostra. Embora o modo de contacto prove útil para uma vasta gama de aplicações, não é como eficaz em amostras relativamente macias. Por outro lado, TappingMode AFM consiste oscilar o modilhão em sua freqüência da ressonância (tipicamente ~300kHz) e fazer a varredura através da superfície com uma constante, amplitude umedecida. O laço de feedback mantem uma amplitude constante (RMS) do rootmean-quadrado movendo o varredor verticalmente durante a exploração, que mantem correspondentemente uma força aplicada constante para formar uma imagem topográfica. A vantagem de TappingMode é que se opera tipicamente com uma força vertical mais baixa do que aquela possível com modo de contacto, e elimina a lateral, as forças de tesoura que podem danificar algumas amostras. Assim, TappingMode transformou-se a técnica preferida para superfícies da imagem lactente macias, frágeis, adesivas, e do relativo à partícula ínfima. AFM na Pesquisa da Entrega do Gene A Terapia genética tem ganhado o impulso como um método eficaz para tratar doenças genético-baseadas. Contudo, um dos obstáculos preliminares que enfrentam este formulário do tratamento está na entrega do material genético condensado a seu alvo pretendido. Há dois métodos comuns de embalar o ADN para a entrega do gene: viral e nonviral. Embora o modo viral-negociado de entrega do gene é actualmente o mais comum, pode ser problemático devido à activação da resposta imunológica de um paciente, que pode eliminar o veículo de entrega do gene antes de usar e produzir outros problemas de saúde. Para evitar estas complicações, os veículos nonviral fabricados fora dos lipossoma ou os polímeros estão sendo usados cada vez mais para encapsular o ADN ou outro materiais relativos droga. O AFM melhorou com sucesso a revelação de tais veículos de entrega do gene fornecendo uma compreensão maior do processo de condensação do ADN. Figura 3 mostra os condensados nonviral do ADN que foram formados com relacionamentos diferentes da carga. 
Figura 3. Quatro estados condensados diferentes de ADN de um estudo de veículos de entrega nonviral do gene: a) - Cobrado em NiCl - mica2tratada negativamente Condensada, b) Condensado negativamente - cobrado com os 0,2 milímetros NiCl2, c) Condensado positivamente - cobrado, d) Noncondensed. Segundo o mecanismo da formação, os condensados são embalados firmemente ou desembaraçados ligeira. varreduras de 1ìm. As Variáveis no processo da formação conduzem ao positivo ou aos condensados cobrados negativo, produzindo vários graus de embalagem do ADN. O AFM oferece uma vantagem distinta sobre outros métodos para investigar os condensados do ADN. Uma das grandes vantagens é a capacidade do AFM para ver a estrutura do veículo de entrega em seu estado hidratado, porque apareceria no uso. Além, com definição da nanômetro-escala do AFM, os pesquisadores enlatam facilmente a imagem as costas do ADN e vêem como reagem e se condensam com um polímero ou um lipossoma particular. Nenhuma outra técnica permite a investigação directa de veículos individuais na alta resolução em um estado hidratado. Por exemplo, há as várias técnicas da partícula-cola que produzem uma distribuição de tamanho sobre um número muito grande de condensados, mas não podem ser aplicados a um condensado individual. Uma das técnicas as mais comuns usadas actualmente é a microscopia de elétron (EM), que oferece a alta resolução necessário ver condensados individuais, mas exige o tempo de preparação significativo da amostra e exige o espécime ser secado em um ambiente do vácuo. Desde Que, secar os veículos de entrega do gene pode mudar sua estrutura, os resultados são, o melhor possível, menos úteis. No pior dos casos, estes resultados podem ser enganadores e resultado em veículos de entrega ineficazes do gene. Geralmente, o AFM é aplicado aos veículos de entrega do gene que estão em uma solução. São injectados na pilha fluida onde anexam a uma carcaça, tipicamente mica. Os veículos são mantidos na superfície de mica pela carga. Positivamente - os condensados cobrados são atraídos naturalmente à carga negativa da superfície de mica, e negativamente - os condensados cobrados podem ser atraídos negativamente - à mica cobrada colocando um cation divalent na solução, ou revestindo a mica com um silane para formar a AP-mica. A imagem lactente do AFM é conduzida então na solução através da técnica de TappingMode. Embora simples preparar-se e executar, o AFM pode assim fornecer muito de alta resolução em condensados individuais do ADN. Estudos da Entrega do Gene Houve um número de estudos AFM-baseados publicados da entrega do gene. Dunlap e os colegas de trabalho estudaram variações nos mecanismos da condensação de ADN supercoiled 5-7kb do plasmídeo de comprimento com um lipido cationic, o lipospermine (dioctadecylamidoglycylspermine ou CÃES), e um polímero cationic, polyethylenimine (PEI). Os condensados resultantes eram imaged por TappingMode na solução do NaCl de 15mM. Para ambos os CÃES e PEI, os laços dobrados do ADN que irradiam dos núcleos centrais eram evidentes, indicando a condensação embalando laços dobrados do ADN. Em Figura 4, os pacotes de ADN podem claramente ser vistos junto com os glóbulo do polímero. Este condensado parcial formou uma estrutura toroidal do circularization de um condensado oblongo connosco múltiplos da condensação. Variando a concentração de CÃES e de PEI, as condições para a condensação completa foram investigadas igualmente. Os condensados Completos de PEI foram encontrados para ser 20 a 40 nanômetros no diâmetro, visto que os condensados completos dos CÃES foram encontrados para ser 50 a 70 nanômetros. Isto sugere que PEI possa ser um agente de condensação mais eficaz do que os CÃES. A diferença em tamanho e a morfologia podem igualmente afectar sua eficiência como um agente do transfection. 
Figura 4. entrega do gene de Nonviral com ADN condensado e um polímero. Os glóbulo de Orangeviolet do polyethylenimine (PEI), um polímero cationic, pacotes circulares estabilizados de ADN verde-amarelo dão laços em um plasmídeo do kilobase cinco. As moléculas Unfixed eram imaged em TappingMode na solução de sal de 15mM. O AFM foi usado igualmente aos processos dinâmicos da imagem in situ para ganhar uma compreensão melhor dos mecanismos da formação associados com a condensação do ADN. A Condensação de poli pegylated (amidoamine) com ADN foi observada na solução aquosa no tempo real. A carga positiva total do condensado polímero-ADN foi usada para guardarar eletrostaticamente negativamente os condensados - à mica cobrada. Contudo, não se guardarou tão rìgida a respeito de impede o movimento dos condensados durante sua formação. A Imagem Lactente dos condensados na solução indicou a presença de estruturas toroidal e haste-como condensadas. Em Figura 5, a formação de um condensado toroidal pode ser considerada sobre um período de 35 minutos. Destas imagens, a estrutura toroidal parece ser formada juntando-se os fins da haste-como o condensado. 
Figura 5. Formação do condensado toroidal do ADN-polímero sobre o período 35 minuto. Barra da Escala = 200nm. As Posteriores investigações mostraram a existência de haste-como e estruturas toroidal em um estado de equilíbrio dinâmico, com os condensados que mudam haste-como de toroidal, e de toroidal haste-como às estruturas. Estudar os processos dinâmicos no tempo real torna possível ganhar uma compreensão melhor da cinética do processo da condensação, que poderia conduzir às melhorias significativas na entrega do gene. Conclusão O AFM demonstrou o sucesso em estudar o nanoscale, estruturas in situ do ADN. Isto tem uma importância óbvia aos esforços para desenvolver uns veículos de entrega mais eficazes do gene. Os Pesquisadores estão utilizando muitos benefícios da definição AFM-alta, preparação simplificada da amostra, investigação do tempo real, imagem lactente não-destrutiva, e a capacidade para executar dentro líquido-a investiga mecanismos da condensação do ADN e vários materiais deempacotamento. Embora os exemplos discutidos acima sejam apenas uma amostra do trabalho que foi conduzido com os microscópios atômicos da força em estudos da entrega do gene, indicam como importante o AFM se realiza ao futuro da terapia genética. Os benefícios originais do AFM jogarão quase certamente um papel crucial na revelação da terapia genética. |