| Атомная микроскопия усилия (AFM) обеспечивает способность выполнить трехмерные измерения поверхностных структур на нанометр-к-subangstrom разрешении в окружающих и жидкостных окружающих средах. Эти возможности водили к новаторский наукам о жизни выдвижения в исследование ДНА, протеинов, и клеток. В частности, фармацевтическое исследование включает несколько применений которые быстро помогают от AFM, и как автономный метод и как мощный комплект к другим общим аналитически методам в настоящее время доступным. Это примечание по применению рассматривает как AFM предлагает уникально возможность сразу, индивидуального исследования кораблей поставки гена на высоком разрешении в ом водой положении. История и Методы AFM AFM наиболее обыкновенно используемая форма семейства микроскопии зонда (SPM) скеннирования методов. Начало SPM начало с развитием микроскопа прокладывать тоннель скеннирования (STM) в 1982 исследователями на IBM, Цюрихе. Способность STM разрешить атомное строение на поверхности образца заработала изобретателям Нобелевскую Премию в 1986. Однако, STM может только быть прикладной к проводным или semiconductive образцам. Для того чтобы расширить этот тип микроскопии к изучению изоляторов, атомный микроскоп усилия был развит в сотрудничестве между IBM и Стэнфордским Университетом в 1986. AFM выполнен путем просматривать острую подсказку на конце гибкого cantilever через поверхность образца, пока поддерживающ малое, постоянная сила (см. Диаграмму 1). 
Диаграмма 1. изображение SEM (увеличение 300X) интегрированного кремния одиночного кристалла консольного и подсказки с радиусом конца 5nm к 10nm. Подсказки типично имеют радиус конца 5nm к 10nm, хотя это может поменять в зависимости от типа подсказки. Движение скеннирования дирижировано пьезоэлектрическим блоком развертки пробки который просматривает подсказку над образцом в картине растра (см. Диаграмму 2). 
Диаграмма 2. Схема главных компонентов атомного микроскопа усилия, показывая цепь обратной связи для деятельности TappingMode. TappingMode и Режим Контакта AFM Взаимодействие подсказк-образца проконтролировано путем отражать лазер с задней части cantilever на детектор разделени-фотодиода. Наиболее обыкновенно используемый режим 2 деятельности режим контакта AFM и TappingMode™ AFM, который можно дирижировать и в окружающих средах воздуха и жидкости. В режиме контакта AFM, постоянн консольное отклонение поддержано цепью обратной связи которая двигает блок развертки вертикально (Z) на каждое боковое (X, Y) частное значение для того чтобы сформировать топографическое изображение. Путем поддержание постоянн отклонения во время скеннирования, постоянн вертикальное усилие поддержано между подсказкой и образцом. Хотя режим контакта доказал полезное для широкого диапазона применений, он нет как эффективно на относительно мягких образцах. С другой стороны, TappingMode AFM состоит из осциллировать cantilever на своей частоте резонанса (типично ~300kHz) и просмотреть через поверхность с константой, амортизированной амплитудой. Цепь обратной связи поддерживает постоянн амплитуду (RMS) rootmean-квадрата путем двигать блок развертки вертикально во время скеннирования, которая соответственно поддерживает постоянн прикладное усилие для того чтобы сформировать топографическое изображение. Преимущество TappingMode что оно типично работает с более низким вертикальным усилием чем то возможное с режимом контакта, и оно исключает боковую часть, усилия ножниц которые могут повредить некоторые образцы. Таким Образом, TappingMode стало предпочитаемым методом для поверхностей воображения мягких, утлых, слипчивых, и частичных. AFM в Исследовании Поставки Джина Терапия Джина приобретала момент как эффективный метод для обрабатывать генетическ-основанные заболевания. Однако, одна из основных препон смотря на эту форму обработки в поставке сконденсированного генетического материала к своей предназначенной цели. 2 общих метода паковать ДНА для поставки гена: вирусно и nonviral. Хотя вирусн-посредничанный режим поставки гена в настоящее время самые общие, он может быть проблемные должными к активации реакции пациента иммунологической, которая может исключить корабль поставки гена перед использованием и произвести другие проблемы здоровья. Для того чтобы во избежание эти усложнения, nonviral корабли изготовленные из липосом или полимеры все больше и больше используются для того чтобы поместить ДНА или другое материалы отнесенные снадобьем. AFM успешно улучшал развитие таких кораблей поставки гена путем обеспечивать большое вникание процесса конденсации ДНА. На Диаграмму 3 показано nonviral конденсаты ДНА которые были сформированы с различными отношениями обязанности. 
Диаграмма 3. 4 различных сконденсированных положения ДНА от изучения nonviral кораблей поставки гена: a) Сконденсированная отрицательно - поручено на NiCl2- обработанная слюда, Сконденсированный b) отрицательно - поручено при 0,2 mM NiCl2, c) Сконденсированный несомненно - поручено, d) Noncondensed. В зависимости от механизма образования, конденсаты плотно упакованы или немножко unraveled. развертки 1ìm. Переменные Величины в процессе образования приводят к в или позитве или порученных недостатком конденсатах, производящ разные степени упаковки ДНА. AFM предлагает определенное преимущество над другими методами для расследовать конденсаты ДНА. Одно из больших преимуществ способность AFM осмотреть структуру корабля поставки в своем ом водой положении, по мере того как оно появилось бы в пользу. В добавлении, с разрешением нанометр-маштаба AFM, исследователя консервируют легко изображение стренги ДНА и видят как они реагируют и конденсируют с определенными полимером или липосомой. Никакой другой метод не позволяет сразу исследованию индивидуальных кораблей на высоком разрешении в ом водой положении. На пример, различные методы частиц-загрунтовкы которые производят распределение по размеру над большое количество конденсатов, но они не могут быть прикладной к индивидуальному конденсату. Один из самых общих в настоящее время используемых методов электронная микроскопия (EM), которая предлагает высокое разрешение необходимо для того чтобы осмотреть индивидуальные конденсаты, но требует значительно времени подготовки образца и требует, что образец высушен - вне в окружающей среде вакуума. В Виду Того Что, сушить вне корабли поставки гена может изменить их структуру, результаты, в лучшем случае, более менее полезны. В худшем случае, эти результаты могут быть обманчивы и результат в недействительных кораблях поставки гена. Вообще, AFM прикладной к кораблям поставки гена которые в разрешении. Они впрыснуты в жидкую клетку где они прикрепляются к субстрату, типично слюду. Корабли держатся на поверхности слюды обязанностью. Несомненно - порученные конденсаты естественно привлечены к отрицательному заряду поверхности слюды, и отрицательно - порученные конденсаты можно привлечь к отрицательно - порученной слюде или устанавливать divalent катион в разрешении, или путем покрывать слюду с силаном для того чтобы сформировать AP-слюду. Воображение AFM после этого дирижировано в разрешении через метод TappingMode. Однако просто для того чтобы подготовить и выполнить, AFM могл таким образом обеспечить очень высок-разрешение на индивидуальных конденсатах ДНА. Изучения Поставки Джина Несколько опубликованных AFM-основанных изучений поставки гена. Dunlap и сотрудники изучили изменения в механизмах конденсации supercoiled ДНА 5-7kb плазмиды в длине с катионоактивным липидом, lipospermine (dioctadecylamidoglycylspermine или СОБАКИ), и катионоактивным полимером, polyethylenimine (PEI). Приводя к конденсаты были imaged TappingMode в разрешении NaCl 15mM. Для обоих СОБАК и PEI, сложенные петли ДНА излучая от центральных ядер были очевидны, показывающ конденсацию путем паковать сложенные петли ДНА. В Диаграмме 4, пачки ДНА можно ясно увидеть вместе с глобулами полимера. Этот частично конденсат формировал toroidal структуру от circularization продолговатого конденсата с множественными узлами конденсации. Путем менять концентрацию СОБАК и PEI, условия для полной конденсации также были расследованы. Были найдены, что были Полные конденсаты PEI 20 до 40 нанометров в диаметре, тогда как были найдены, что были полные конденсаты СОБАК 50 до 70 нанометров. Это предлагает что PEI может быть более эффективным конденсируя агентом чем СОБАКИ. Разница в размере и словотолковании может также повлиять на их эффективность как агент transfection. 
Диаграмма 4. поставка гена Nonviral с сконденсированным ДНА и полимером. Глобулы Orangeviolet polyethylenimine (PEI), катионоактивного полимера, стабилизированные круговые пачки желт-зеленого ДНА закрепляют петлей в плазмиде kilobase 5. Незафиксированные молекулы были imaged в TappingMode в солянном растворе 15mM. AFM также был использован к процессам изображения динамическим в situ для того чтобы приобрести более лучшее вникание механизмов образования связанных с конденсацией ДНА. Конденсация pegylated поли (amidoamine) с ДНА наблюдалась в водном растворе в реальное временя. Общая положительная обязанность конденсата полимер-ДНА была использована электростатически для того чтобы держать конденсаты к отрицательно - порученной слюде. Однако, не держалось настолько твердо о предотвращает движение конденсатов во время их образования. Воображение конденсатов в разрешении показало присутсвие toroidal и штанг-как конденсатных структур. В Диаграмме 5, образование toroidal конденсата можно увидеть над timespan 35 минут. От этих изображений, кажется, что сформирована toroidal структура путем соединять концы a штанг-как конденсат. 
Диаграмма 5. Образование toroidal конденсата Дна-полимера над мельчайшей врем-пядью 35. Адвокатское сословие Маштаба = 200nm. Дальнейшие расследования показывали существование штанг-как и toroidal структуры в положении динамического равновесия, при конденсаты изменяя от штанг-как к toroidal, и toroidal к штанг-как структурам. Изучать динамические процессы в реальное временя делает его возможным приобрести более лучшее вникание кинетики процесса конденсации, который смог вести к значительно улучшениям в поставке гена. Заключение AFM демонстрировал успех в изучать nanoscale, в структурах ДНА situ. Это имеет очевидную релевантность к усилиям развить более эффективные корабли поставки гена. Исследователя используют много преимуществ AFM-высокого разрешения, упрощенной подготовки образца, в реальном масштабе времени исследования, воображения без разрушения, и способность выполнить внутри жидкост-к расследует механизмы конденсации ДНА и различные Джин-упаковывая материалы. Хотя примеры обсуженные выше как раз забор работы которая была дирижирована с атомными микроскопами усилия в изучениях поставки гена, они показывают как важно AFM к будущему терапии гена. Уникально преимущества AFM почти определенно сыграют критическую роль в развитии терапией гена. |