| Atom- styrkamicroscopy (AFM) ger kapaciteten att utföra tredimensionella mätningar av ytbehandlar strukturerar på nanometer-till-subangstrom upplösning i omgivande och vätskemiljöer. Dessa kapaciteter har ledde till mala-brytande vetenskaperna om olika organismers beskaffenhet framflyttningar i utredningen av DNA, proteiner och celler. I synnerhet gäller farmaceutisk forskning ett nummer av applikationer som gynnar snabbt från AFM, både som en fristående teknik och som ett kraftigt komplement till de andra för närvarande tillgängliga analytiska teknikerna för allmänningen. Denna applikation noterar undersöker hur AFM erbjuder den unika kapaciteten av riktar, individutredning av genleveransmedel på kickupplösning i ett hydratiserat statligt. AFM-Historia och Metoder AFM är som används mest gemensam, bildar av familjen för scanningsond (SPM)microscopy av tekniker. Beskärningen av SPM började med utvecklingen av scanningen som gräver mikroskopet (STM) i 1982 av forskare på IBM, Zurich. Kapaciteten av STMEN att lösa atom- strukturerar på en ta prov ytbehandlar tjänade uppfinnarearna den Nobel Prisen i 1986. Emellertid kan STMEN endast appliceras till ledande eller semiconductive prov. Att bredda denna typ av microscopy till studien av isolatorer, framkallades det atom- styrkamikroskopet i samarbete mellan IBM och Stanford-Universiteten i 1986. AFM utförs, genom att avläsa en korspets på avsluta av en böjlig cantilever över en ta prov, ytbehandlar, stunder som underhåller en liten konstant styrka (se för att Figurera 1). 
Figurera 1. SEM 2000 avbildar (förstoring 300X) av en crystal silikoncantilever för inbyggd singel och tippar med en avslutaradie av 5nm till 10nm. Spetsarna har typisk en avslutaradie av 5nm till 10nm, även om denna kan variera beroende av spetstyp. Scanningen vinkar föras av en piezoelectric rörbildläsare som avläser spetsen över ta prov i ett raster mönstrar (se för att Figurera 2). 
Figurera 2. Schematiskt av ha som huvudämnedelarna av ett atom- styrkamikroskop, visning som återkopplingen kretsar för den TappingMode funktionen. TappingMode och KontaktFunktionsläge AFM Spets-ta prov växelverkan övervakas, genom att reflektera en laser av baksidaen av cantileveren på enfotodiod avkännare. Det mest gemensam använda funktionsläget två av funktionen är kontaktfunktionsläget AFM, och TappingMode™ AFM, som kan föras i båda, luftar och vätskemiljöer. I kontaktfunktionsläget AFM, underhålls en konstant cantileveravböjning av en återkoppling kretsar att flyttningar som bildläsaren (Z) på varje sido(X, Y) data pekar vertikalt för att bilda det topographic avbildar. Genom att underhålla en konstant avböjning under scanning, underhålls tar prov en konstant lodlinjestyrka mellan spetsen och. Även Om kontaktfunktionsläget har bevisat användbart för en lång räcka av applikationer, är det inte, som effektivt på förhållandevis mjukt tar prov. Å andra sidan består TappingMode AFM av att svänga cantileveren på dess resonansfrekvens (typisk ~300kHz) och att avläsa över ytbehandla med en konstant, fuktad amplitud. Återkopplingen kretsar underhåller en konstant rootmean-kvadrerar (RMS) amplitud vid flyttning bildläsaren vertikalt under scanningen, som underhåller i motsvarande grad konstanten applicerad styrka för att bilda ett topographic avbildar. Fördelen av TappingMode är att den fungerar typisk med en lägre lodlinjestyrka än den möjlighet med kontaktfunktionsläge, och den avlägsnar lateralen, saxstyrkor som kan skada något tar prov. Således har TappingMode blivit den föredragna tekniken för att avbilda som är mjukt, bräckligt, adhesive, och ämne som består av partiklar ytbehandlar. AFM i GenLeveransForskning Genterapi har nått momentum som en effektiv metod för att behandla genetisk-baserade sjukdomar. Emellertid bildar ett av de primära hindren som vänder mot detta, av behandling är i leveransen av det förtätade genetiska materiellt till påtänkt dess uppsätta som mål. Det finns två vanligt metoder av att packa DNA för genleverans: virus- och nonviral. Fast detmedlade funktionsläget av genleveransen är för närvarande den mest allmänningen, kan det vara problematiskt tack vare aktiveringen av en tålmodigs immunological svar, som kan avlägsna genleveransmedlet för bruk och jordbruksprodukter andra hälsoproblem. Att undvika dessa komplikationer är nonviral medel som fabriceras ut ur liposomes, eller polymrer mer och mer van vid encapsulate DNAEN eller annan drogen släkta material. AFM har lyckat förbättrat utvecklingen av sådan genleveransmedel, genom att ge en mer stor överenskommelse av det processaa av DNA-kondensation. Figurera 3 nonviral DNA-condensates för shows som bildades med olika laddningsförhållanden. 
Figurera 3. Fyra olika förtätat påstår av DNA från en studie av nonviral genleveransmedel: a) Kondenserad negativt - laddat på NiCl2- behandlad mica, Kondenserat b) negativt - laddat med 0,2 en mm NiCl2, c) som positivt Kondenseras - laddat, D) Noncondensed. Beroende av bildandemekanismen packas rivas upp condensatesna stramt eller litet. 1ìm bildläsningar. Variabler i bildandet bearbetar resultat i endera realitet eller negationen laddade condensates och att producera varierande grader av DNA-emballage. AFM erbjuder en distinkt fördel över andra metoder för att utforska DNA-condensatesna. En av de mest stora fördelarna är AFMS kapacitet att beskåda strukturera av leveransmedlet i dess hydratiserade statligt, som den skulle verkar i bruk. I tillägg med AFMS nanometer-fjäll upplösning kan forskare lätt avbilda DNAEN strandar och ser hur de reagerar och kondenserar med en särskild polymer eller liposome. Ingen annan teknik låter riktar utredning av individmedel på kickupplösning i ett hydratiserat statligt. För anföra som exempel, där var olika partikel-storleksanpassa tekniker som jordbruksprodukter en storleksanpassafördelning över mycket en stort antal av condensates, utan dem inte kan appliceras till en individcondensate. En av de mest allmänningteknikerna som används för närvarande, är elektronmicroscopy (EM), som erbjuder kickupplösningen som behövs för att beskåda individcondensates, men kräver viktigt tar prov förberedelsetid och kräver prov att torkas - ut i en dammsugamiljö. Strukturera, resultaten är, på bäst, mindre användbart, Sedan uttorkning ut genleveransmedlen kan ändra deras. På värst kan dessa resultat vara vilseledande och resultatet i ineffektiva genleveransmedel. Allmänt appliceras AFM till genleveransmedel som är i en lösning. De injiceras in i den fluid cellen, var de fäster till en substrate, typisk mica. Medlen rymms på micaen ytbehandlar vid laddningen. Positivt - laddade condensates tilldras naturligt till negationladdningen av micaen ytbehandlar, och negativt - laddade condensates kan tilldras till negativt - den laddade micaen, genom endera att förlägga en divalent cation i lösningen eller genom att täcka micaen med en silane för att bilda AP-mica. Att avbilda för AFM föras därefter i lösning via den TappingMode tekniken. Though enkelt att förbereda sig och utföra, är AFM thus kompetent att ge mycket med hög upplösning på individDNA-condensates. GenLeveransStudier Det har finnas ett nummer av publicerade AFM-baserade genleveransstudier. Dunlap och för medarbetare utstuderade variationer i kondensationsmekanismen av supercoiled plasmidDNA 5-7kb i längd med en cationic lipid, lipospermine (dioctadecylamidoglycylsperminen eller HUNDKAPPLÖPNING) och en cationic polymer, polyethylenimine (PEI). De resulterande condensatesna avbildades av TappingMode i 15mM NaCl-lösning. För båda HUNDKAPPLÖPNING och PEI kretsar vikt DNA att utstråla från central kärnar ur var tydlig och att indikera att kondensation, genom vikt att packa kretsar av DNA. I Figurera 4, packar av DNA kan klart ses tillsammans med polymerliten kula. Denna partiska condensate har bildat ett toroidal strukturerar från circularizationen av en avlång condensate med multipelkondensationsknutpunkter. Vid varierande villkorar koncentrationen av HUNDKAPPLÖPNING och PEI, för färdig kondensation utforskades också. Färdiga PEI-condensates fanns för att vara 20 till 40 nanometers i diameter, eftersom färdiga HUNDKAPPLÖPNINGcondensates fanns för att vara 50 till 70 nanometers. Detta föreslår att PEI kan vara ett effektivare kondensera medel än HUNDKAPPLÖPNINGEN. Skillnaden storleksanpassar in, och morfologi kan också påverka deras effektivitet som ett transfectionmedel. 
Figurera 4. Nonviral genleverans med förtätad DNA och en polymer. Orangeviolet liten kula av polyethyleniminen (PEI), en cationic polymer, stabiliserade cirkulärpackar av guling-gräsplan DNA kretsar i en plasmid för kilobase fem. Unfixed molekylar avbildades i TappingMode i 15mM den salt lösningen. AFM har också varit van vid avbildar dynamiskt bearbetar i situ för att nå en bättre överenskommelse av bildandemekanismen som är tillhörande med DNA-kondensation. Kondensation av pegylated poly (amidoamine) med DNA har observerats i aqueous lösning i real-time. Den total- realitetladdningen av condensaten polymer-DNA var van vid rymmer elektrostatiskt condensatesna till negativt - den laddade micaen. Emellertid rymdes det inte så styvt om förhindrar rörelse av condensatesna under deras bildande. att Avbilda av condensatesna i lösning indikerade att närvaroen av den toroidal och stång-något liknande condensaten strukturerar. I Figurera 5, bildandet av en toroidal condensate kan ses över en timespan av 35 noterar. Från dessa avbildar, det toroidal strukturerar verkar att bildas, genom att sammanfoga, avslutar av ennågot liknande condensate. 
Figurera 5. Bildande av den toroidal DNA-polymern condensaten över minimala 35 Time-spänner över. Fjäll bommar för = 200nm. mer Ytterligare utredningar har visat att existensen av stång-något liknande och det toroidal strukturerar i ett statligt av dynamisk equilibrium, med condensatesna som ändrar från stång-något liknande till toroidal, och toroidal till stång-något liknande strukturerar. Studera det dynamiskt bearbetar i real-time gör det möjlighet för att nå en bättre överenskommelse av kineticsen av den processaa kondensationen, som kunde leda till viktiga förbättringar i genleverans. Avslutning AFM har visat framgång, i att studera nanoscale, i situDNA, strukturerar. Detta har en tydlig relevans till försök att framkalla effektivare genleveransmedel. Forskare använder många gynnar av AFM-kick upplösning, förenklat ta prov förberedelsen, realtidsutredning, oskadligt avbilda, och kapaciteten att utföra in flytande-till utforskar DNA-kondensationsmekanism och olika gen-paketera material. Även Om exemplen som över diskuteras, är precis en provtagning av arbetet som har förats med atom- styrkamikroskop i genleveransstudier, indikerar de hur viktigt AFMEN äger rum till framtiden av genterapi. Det unikt gynnar av AFM ska nästan bestämt lek en avgörande roll i genterapiutveckling. |