Simultane AtomKraft und Fluoreszenz-Mikroskopie Unter Verwendung des MFP-3D FLUGHANDBUCHS Von der Asyl-Forschung

Themen Umfaßt

Hintergrund
Kombination der AtomKraft-Mikroskopie und der Fluoreszenz-Mikroskopie
Instrumentierung Anforderungen
Beschreibung und Installation
Probenaufbereitung
Bild Beispiele
Anwendungen
Epifluorescence und FLUGHANDBUCH
GITTERWERK und FLUGHANDBUCH
NSOM und FLUGHANDBUCH
TIRF und FLUGHANDBUCH
Schlussfolgerung

Hintergrund

AtomKraft-Mikroskopie und (AFM) Fluoreszenzmikroskopie Zu Kombinieren (FM) ist lang von den Zinsen für Biologen gewesen. Diese zwei Baumuster von Mikroskopen liefern einzeln eindeutige Informationen über Proben.

Kombination der AtomKraft-Mikroskopie und der Fluoreszenz-Mikroskopie

Fluoreszenzmikroskopie wird gewöhnlich verwendet, um spezifische Moleküle zu entdecken. Jedoch hat diese Mikroskopietechnik häufig einige Nachteile einschließlich begrenzte Ortsauflösung und komplexe Probenaufbereitung. Eine Andere Beschränkung dieser Mikroskopie ist, dass das Molekül zum Fluorochrom gesprungen werden muss, das der Reihe nach, kann den Zustand des Moleküls ändern.

andererseits ist FLUGHANDBUCH ein Maß, das mit einem Kragbalken gemacht wird, der gescanntes Kreuz die Oberfläche ist.

Abbildung 1. Die MFP-3D - BIO erlaubt simultane optische und FLUGHANDBUCH-Maße auf einem umgekehrten optischen microsope, das für Biowissenschaftsanwendungen ideal ist.

Es stellt dreidimensionale molekulare Auflösung von biologischen Molekülen ohne zusätzlichen kontrastierenden Agens (wie Fluorochrom, Farben, Usw.) oder von Kompromiss zur Probe zur Verfügung. Darüber hinaus ist FLUGHANDBUCH auch ein höheres Auflösungsmaß, das nicht-flüchtig ist.

Unter Verwendung dieser Mikroskopie versieht Techniken gleichzeitig den Benutzer mit Darstellung der hohen Auflösung auf spezifischen Molekülen und öffnet auch die Klappe zu einer großen Vielfalt von Forschungsexperimenten. In diesem Artikel beschreiben wir die Instrumentierung und die Installation, Probenaufbereitung, Anwendungen und nennen experimentelle Beispiele der Technik.

Instrumentierung Anforderungen

Erfolgreiche simultane FLUGHANDBUCH- und FM-Maße benötigen spezifische Konfigurationen beider Instrumente. In erster Linie darf das FLUGHANDBUCH nicht FM-Maß behindern. Weil die meisten roten Laserdioden gewerblicher AFMs-Nutzung, zum des Ausschlags des Kragbalkens zu leuchten und zu entdecken, die Leuchtstoffwellenlängen nicht beobachtet werden können. Jedoch verwendet die Asyl-Forschung MFP-3D eine superluminescent Infrarotdiode mit verringerten Leuchtstoffwellenlängen der Emission höchstens. Dieses erlaubt das Betrachten der Fluoreszenz und DES FLUGHANDBUCH-Bildes (siehe Abbildung 2).

Abbildung 2. Fluorochrom-Erregung (blaues) /Emission (rot) und MFP-3D SLD Leuchtenwellenlänge.

Darüber hinaus haben beide Maße möglicherweise kontroverse räumliche Beschränkungen. Das FM-Mikroskop benötigt, dass die Probe zu den Lernzielen des umgekehrten Mikroskops nah ist. Für das FLUGHANDBUCH muss sich der Kragbalken nah an der Probe für Darstellung auch befinden. Das MFP-3D wird speziell konstruiert, damit die Probe durch das umgekehrte optische Mikroskop und die Scannenstufe des FLUGHANDBUCHS erreicht werden kann.

Der MFP-3D Scanner steht auf die Oberseite eines umgekehrten Mikroskops still und bietet fast unbegrenzten optischen Zugang zur Probe von unterhalb und macht sie einfach, mit Fluoreszenzmikroskopen, einschließlich epifluorescence, confocal, TIRF und GITTERWERK zu kombinieren.

Beschreibung und Installation

Das MFP-3D-BIO FLUGHANDBUCH ist das ideale Instrument, zum der simultanen Maße durchzuführen. Dieses Baumuster hat eine Grundplatte und einen X-Yscanner, die oben auf ein umgekehrtes optisches Mikroskop stillstehen (hergestellt durch Olymp, Zeiss oder Nikon). Diese Stufen- und Scanner-Anordnung erlaubt einfache Ausrichtung der FLUGHANDBUCH-Spitze mit der optischer Schwerpunkts- und Submikronpositionierung der Probe in zwei Abmessungen. Sie ist auch mit allen umgekehrten optischen Lernzielen einschließlich hohe numerische Öffnung 100X und TIRF-Lernziele kompatibel. Abbildung 1 zeigt eine Installation des MFP-3D-BIO, das an einem Nikon TE2000-E ausgerüstet für Fluoreszenz montiert wird.

Während der Operation strahlt das MFP-3D FLUGHANDBUCH Infrarot-SLD zwischen 840 und 880nm aus. Weil die meisten fluorophores Erregungs- und Emissionswellenlängen unterhalb dieser Werte haben, gibt es keine Störung (siehe Abbildung 2).

Probenaufbereitung

Die Probenaufbereitung für simultane Maße ist der ähnlich, die für FLUGHANDBUCH-Darstellung verwendet wird. Jedoch in der Fluoreszenzmikroskopie, können Lichtsignale schwach sein. Einige geläufige Methoden des Erhöhens der Leistungsfähigkeit der Leuchtstoffemissionen können nicht im MFP-3D, weil es den FLUGHANDBUCH-Fühler am Kommen in Kontakt mit dem Beispiel-¨C zum Beispiel verhindern würde, unter Verwendung eines hydrophoben Mediums und des Ersetzens des Wassers durch Glyzerin oder des Hinzufügens von Antioxydantien angewendet werden, um die Leistungsfähigkeit der Fluoreszenz zu erhöhen.

Diese Methoden benötigen gewöhnlich, dass ein Deckglas oben auf die Probe gelegt wird, um sie zu schützen und zu konservieren. Da solch ein Deckglas den FLUGHANDBUCH-Fühler am Einwirken auf die Probe verhindert, muss dieser Schritt in der Probenaufbereitung ausgelassen werden. Stattdessen muss Vorbereitung zu jeder Probe hergestellt werden und die Menge der Leuchtstofffarbe muss den neuen Darstellungszuständen angepasst werden. Zum Beispiel wäre möglicherweise es notwendig, die Menge des Fluorochroms zu erhöhen, das an das Probenmaterial binden wird, um ein größeres Signal für das FM-Maß zu erhalten. Anmerkung jedoch dass, da diese möglicherweise einen Verlust der verbindlichen Besonderheit der Farbe und einen Kompromiss ergibt, muss möglicherweise gefunden werden.

Bild Beispiele

Abbildung 3 zeigt Lokolisierung von Actinfäden im Verhältnis zu der Oberflächentopographie von Einzelzellen unter Verwendung eines kombinierten TIRFM/AFM. Helazellen wurden auf Glasmikroskopdeckgläsern, Formalin-örtlich festgelegt gewachsen, permeabilized mit Triton X-100, beschriftet mit TRITC-phalloidin, gewaschen mit Aceton und getrocknet. Darstellung wurde unter Verwendung einer kundenspezifischen Kombination des MFP-3D FLUGHANDBUCHS und des TIRF-Mikroskops durchgeführt, die auf einem Mikroskop Olymp IX81 konstruiert wurden. Topographische und Fluoreszenzdaten wurden gleichzeitig montiert. Topographische Daten wurden im berührungsfreien Modus unter Verwendung eines Sündenkragbalkens (Olymp AC160) erworben. Das Bild zeigt den TIRF-Nachrichtenkanal, der auf der übertragenen FLUGHANDBUCH-Topographie bedeckt wird.

Abbildung 3. TIRF-Daten bedeckt auf übertragener FLUGHANDBUCH-Topographie von HelaZellen. Bildhöflichkeit Miklós S.Z. Kellermayer, Nanobiotechnologie-und Einzel-Molekül Biophysik-Gruppe, Universität von Pécs, Ungarn.

Abbildung 4 zeigt ein Beispiel einer Epithelzelle. Diese Bilder wurden mit einem Ölkapselungs-Fluorlernziel 100X Nikon S genommen. Das graue Bild ist ein brightfield Bild mit etwas zusätzlicher weißer Leuchte, welche die Beispielregion leuchtet. Dieses erlaubt, dass der Kragbalken (Olymp WS 240) auch sichtbar gemacht wird. Das zweite Bild in der Reihenfolge ist das Fluoreszenzbild. Das dritte Bild ist das FLUGHANDBUCH-Bild des gleichen Zelle eingelassenen WS-Modus. Sie können das laute Summen des speziellen Bereichs innerhalb der Zellregion auch sehen.

Abbildung 4. (a) optischer Phasenkontrast, (b) Fluoreszenz, (c) FLUGHANDBUCH und (d) kombiniertes AFM/fluorescence von örtlich festgelegten menschlichen Lungenfibroblasten, 60µm Scan.

Abbildung 5 ist ein optisches Bild von den Bakterien (Pseudomonas-Aeruginosa) ein Grünes LeuchtstoffProtein und (GFP) entsprechenden Kraftkurven zeigend. Das Bild wurde mit einem objektiven 10X genommen und einen Leuchtstofffilter Würfels Nikon FITCHYQ verwendete. Weiße Leuchte von einer Faserquelle wurde auch verwendet, um den Kragbalken zu leuchten (sichtbar auf der linken Seite des Bildes). Die Bakterien waren erste gewachsen in einer mittleren Suspension. Die Suspension wurde dann über einen Objektträger einige Stunden lang geleert, damit die Bakterien einen Biofilmanhänger auf Glas wachsen. Der Objektträger wurde dann mit dem Zellkulturmedium und abgebildet im gleichen Medium ausgespült. Der Kragbalken, der in diesem Maß verwendet wird, ist ein 60¦Ìm langer Olymp-Bio-Hebel (sichtbar als dunkler Schatten im brightfield Bild).

Anwendungen

Es gibt viele Anwendungsbeispiele von FLUGHANDBUCH- und epifluorescence¨c Nahfeld, das Optische Mikroskop- (NSOM) Scannt, confocal, Interne Reflexions-Fluoreszenz- (TIRF)und Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Übergangs (FRET)gesamtmethoden. Forscher sind mit dem Risiko der Abänderung der Anpassung des Probenmaterials mit dem Fluorochrom betroffen möglicherweise und so etwas auch kompromittieren das FLUGHANDBUCH. Jedoch beschriften Techniken, die dieses Problem herabsetzen. Eine Technik ist, eine geänderte und Leuchtstoffaminosäure in einem Protein einzuschieben (wie Einschieben methylglyoxal im Kollagen). Viele Experimente stellen nicht diesen Punkt überhaupt dar, besonders wenn das FLUGHANDBUCH verwendet wird, um ein Probenmaterial und nicht zum Bild mechanisch zu starten es.

Epifluorescence und FLUGHANDBUCH

  • Kennzeichnungsproteine oder andere Bauteile auf einer Zellmembran. Epifluorescence wird verwendet, um die Membran optisch zu errichten und FLUGHANDBUCH wird verwendet, um ein Hochmolekularauflösungsbild zu erhalten (wie in Abbildung 4) oder mechanischen Eigenschaften der Maßnahme der Proben gezeigt (siehe Abbildung 5).
  • Beschriftende bestimmte Lipide (wie DPPC) zum der Flüssigkeit der Zellmembran durch ÜbereinstimmungsFM- und FLUGHANDBUCH-Bilder zu studieren.
  • Die Zusammensetzung und die Verteilung von Lipiden in den Bäschen durch epifluorescence und die Anwendung simultanen FLUGHANDBUCHS Studieren, Daten über die mechanischen und viskoelastischen Eigenschaften der gleichen Bäschen zu erhalten.
  • Die Zelle von Chromophoren, wie Carotinoiden und Chlorophyll, in Bezug auf ein ihr optisches Verhalten Studieren.
  • Erregen Sie Mechanisch eine Zelle, oder sogar fließen einige Empfänger an der Oberfläche einer Zellmembran mit dem FLUGHANDBUCH und der Anwendung FMS, einem gestarteten Schubumkehrgitter von biochemischen Reaktionen, wie Ca2+ optisch zu folgen innerhalb der Zelle.

Abbildung 5. (Oberseite) das optische Bild wurde verwendet, um die Bakterien zu errichten und den Kragbalken in Position zu bringen. Kraftmessungen wurden dann auf den Bakterien gemacht, um die Härte der Zelle (unteres Bild) einzuschätzen. Die Probe ist die Pseudomonas-Aeruginosa, die GFP zeigt. In den Kraftkurven entspricht die blaue Kurve dem Ausschlag des Kragbalkens, wenn sie von der Oberfläche entnommen wird, und die rote Kurve entspricht dem Ausschlag, während sie der Oberfläche sich nähert. Vergleichen Sie die Kraftkurve, die auf den Bakterien mit der auf einer Glassubstratfläche genommen wird. Das auffallendste Merkmal ist der große Beitritt (sichtbar als negativer Ausschlag auf der blauen Einfahrenkurve). Prüfen Sie Höflichkeit von Terry Beveridge, Universität von Guelph, Kanada.

GITTERWERK und FLUGHANDBUCH

GITTERWERK wird für das Messen von Näherungsbeziehungen in den Proteinen, in den Nukleinsäuren und in den Membranen verwendet. Unter Verwendung einer GITTERWERK-Methode ist es möglich, die dynamische von den Änderungen in der Anpassung wie DNS oder molekulare Interaktion zwischen zwei Instanzen zu studieren. FLUGHANDBUCH kann gleichzeitig verwendet werden, um diese Ereignisse sichtbar zu machen.

NSOM und FLUGHANDBUCH

Simultane FLUGHANDBUCH- und NSOM-Darstellung von Zellen ermöglichen topographische Darstellung und die Bestimmung der elastischen Eigenschaften der Membran.

TIRF und FLUGHANDBUCH

Diese Technik kann verwendet werden, um die Antwort von Zellen zu den lokalisierten Kräften zu studieren, die über den Kragbalken auf die Oberseite der Zellen aufgewendet werden. Im Allgemeinen, wird sie verwendet, um Zellen auf der nmstufe mit dem FLUGHANDBUCH-Fühler zu manipulieren, der verwendet wird, um der Zellreaktion mit Fluoreszenz zu folgen.

Schlussfolgerung

Das MFP-3D-BIO von der Asyl-Forschung ist das Instrument der Wahl für simultane FLUGHANDBUCH- und Fluoreszenzmaße. Seine eindeutige Auslegung erlaubt, dass diese Maße leicht und genau gemacht werden. Indem sie einfach die normale FLUGHANDBUCH-Probenaufbereitung ändern, können Forscher diese Maße durchführen und ihre Experimente zu einer grenzenlosen Anzahl von Biowissenschaftsanwendungen erweitern.

Quelle: Asyl Forschung

Zu mehr Information über diese Quelle besuchen Sie bitte Asyl-Forschung

Date Added: Jul 26, 2006 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 09:26

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