Fuerza y Microscopia de Fluorescencia Atómicas Simultáneas Usando el MFP-3D AFM De la Investigación del Asilo

Temas Revestidos

Antecedentes
Combinar Microscopia Atómica de la Fuerza y Microscopia de Fluorescencia
Requisitos de la Instrumentación
Descripción y Ajuste
Preparación de la Muestra
Ejemplos de la Imagen
Aplicaciones
Epifluorescence y AFM
TRASTE y AFM
NSOM y AFM
TIRF y AFM
Conclusión

Antecedentes

Combinar Microscopia Atómica de la Fuerza (AFM) y microscopia de fluorescencia (FM) ha estado de largo de interés para los biólogos. Estos dos tipos de microscopios proporcionan individualmente a la información única sobre muestras.

Combinar Microscopia Atómica de la Fuerza y Microscopia de Fluorescencia

La microscopia de Fluorescencia se utiliza típicamente para detectar las moléculas específicas. Sin Embargo, esta técnica de la microscopia tiene con frecuencia varias desventajas incluyendo la resolución espacial limitada y la preparación compleja de la muestra. Otra limitación de esta microscopia es que la molécula se debe limitar al fluorocromo, que a su vez, puede alterar el estado de la molécula.

por otra parte, el AFM es una medición hecha con un voladizo que sea cruz explorada la superficie.

Cuadro 1. Los MFP-3D - BIO permite mediciones ópticas y del AFM simultáneas en un microsope óptico invertido, ideal para las aplicaciones de la ciencia biológica.

Proporciona a la resolución molecular tridimensional de moléculas biológicas sin agente que pone en contraste adicional (tal como fluorocromo, tintes, Etc.) o del compromiso a la muestra. Además, el AFM es también una medición más de alta resolución que es no-efímera.

Usando esta microscopia las técnicas proveen simultáneamente del utilizador proyección de imagen de alta resolución en las moléculas específicas y también abren la puerta en una amplia variedad de experimentos de la investigación. En este artículo, describiremos la instrumentación y el ajuste, preparación de la muestra, aplicaciones, y damos los ejemplos experimentales de la técnica.

Requisitos de la Instrumentación

Las mediciones simultáneas Acertadas del AFM y de FM requieren configuraciones específicas de ambos instrumentos. Sobre todo, el AFM no debe interferir con la medición de FM. Porque la mayoría de los diodos láser rojos del uso comercial de AFMs para iluminar y para detectar la desviación del voladizo, las longitudes de onda fluorescentes no pueden ser observados. Sin Embargo, la Investigación MFP-3D del Asilo utiliza un diodo superluminescent infrarrojo con longitudes de onda fluorescentes reducidas de la emisión a lo más. Esto permite la visión de la fluorescencia y de la imagen del AFM (véase el Cuadro 2).

Cuadro 2. Excitación del Fluorocromo /Emission (azul) (rojo) y longitud de onda de la luz de MFP-3D SLD.

Además, ambas mediciones tienen apremios espaciales potencialmente en conflicto. El microscopio de FM requiere que la muestra esté cercana a los objetivos del microscopio invertido. Para el AFM, el voladizo debe también residir cerca de la muestra para la proyección de imagen. El MFP-3D se diseña específicamente para poder alcanzar la muestra por el microscopio óptico invertido y el escenario de la exploración del AFM.

El analizador de MFP-3D descansa sobre la parte superior de un microscopio invertido y proporciona al acceso óptico casi ilimitado a la muestra de debajo, haciéndola fácil combinar con los microscopios de fluorescencia, incluyendo epifluorescence, confocal, TIRF y TRASTE.

Descripción y Ajuste

El MFP-3D-BIO AFM es el instrumento ideal para realizar las mediciones simultáneas. Este modelo tiene un embase y un analizador X-Y que descansen encima de un microscopio óptico invertido (manufacturado por Olympus, Zeiss o Nikon). Esta ordenación del escenario y del analizador permite la alineación simple de la punta del AFM con la colocación del eje óptico y del submicron de la muestra en dos dimensiones. Es también compatible con cualquier objetivo óptico invertido incluyendo la alta apertura numérica 100X y objetivos de TIRF. El Cuadro 1 muestra un ajuste del MFP-3D-BIO montado en Nikon TE2000-E equipado para la fluorescencia.

Durante la operación, el MFP-3D AFM SLD infrarrojo emite entre 840 y 880nm. Porque la mayoría de los fluorophores tienen longitudes de onda de la excitación y de la emisión debajo de estos valores, no hay interferencia (véase el Cuadro 2).

Muestree la Preparación

La preparación de la muestra para las mediciones simultáneas es similar a ésa usada para la proyección de imagen del AFM. Sin Embargo, en microscopia de fluorescencia, las señales pálidas pueden ser débiles. Algunos métodos comunes de aumentar la eficiencia de emisiones fluorescentes no se pueden utilizar en el MFP-3D porque evitaría que la antena del AFM entrara en el contacto con el ¨C de la muestra por ejemplo, usando un media hidrofóbico y reemplazar el agua por glicerol, o agregar los antioxidantes, para aumentar la eficiencia de la fluorescencia.

Estos métodos requieren típicamente que una tira esté colocada encima de la muestra para protegerla y para preservar. Puesto Que tal tira evita que la antena del AFM obre recíprocamente con la muestra, este paso de progresión en la preparación de la muestra debe ser omitido. En Lugar, la preparación se debe adaptar a cada muestra y la cantidad de tinte fluorescente tiene que ser adaptada a las nuevas condiciones de la proyección de imagen. Por ejemplo, puede ser que sea necesario aumentar la cantidad de fluorocromo que va a atar al espécimen para obtener una señal más grande para la medición de FM. La Nota, sin embargo, que puesto que ésta puede dar lugar a una baja de la especificidad obligatoria del tinte, y a un compromiso puede necesitar ser encontrado.

Ejemplos de la Imagen

El Cuadro 3 muestra la localización de los filamentos de la actinia en relación con la topografía superficial de células usando un TIRFM/AFM combinado. Las células HeLa fueron crecidas en las tiras de cristal del microscopio, formalina-fijo, permeabilized con Tritón X-100, etiqueta con TRITC-phalloidin, lavadas con la acetona y secadas. La Proyección De Imagen fue realizada usando una combinación a la medida del MFP-3D AFM y un microscopio de TIRF construido en un microscopio de Olympus IX81. Los datos Topográficos y de la fluorescencia cerco simultáneamente. Los datos Topográficos fueron detectados en modo sin contacto usando un voladizo del Pecado (Olympus AC160). La imagen muestra el canal de datos de TIRF sobrepuesto en la topografía rendida del AFM.

Cuadro 3. datos de TIRF sobrepuestos en la topografía rendida del AFM de Células HeLa. Grupo de la cortesía de Imagen Miklós S.Z. Kellermayer, de la Nanobiotecnología y de la Biofísica de la Único-Molécula, Universidad de Pécs, Hungría.

El Cuadro 4 muestra un ejemplo de una célula epitelial. Estas imágenes fueron tomadas con un objetivo de immersión en aceite del fluor de 100X Nikon S. La imagen gris es una imagen del brightfield con una cierta luz blanca adicional que ilumina la región de la muestra. Esto permite que el voladizo (CA 240 de Olympus) sea visualizado también. La segunda imagen en la serie es la imagen de la fluorescencia. La tercera imagen es la imagen del AFM del mismo modo admitido célula de la CA. Usted puede también ver el zoom del área específica dentro de la región de la célula.

Cuadro 4. (a) contraste óptico de la fase, (b) fluorescencia, (c) AFM, y (d) AFM/fluorescence combinado de los fibroblastos humanos fijos del pulmón, exploración de los 60µm.

El Cuadro 5 es una imagen óptica de las bacterias (Pseudomonas Aeruginosa) que muestran una Proteína Fluorescente Verde (GFP) y curvas correspondientes de la fuerza. La imagen fue tomada con un 10X objetivo y utilizó un filtro fluorescente del cubo de Nikon FITCHYQ. La luz Blanca de una fuente de la fibra también fue utilizada para iluminar el voladizo (visible en el lado izquierdo de la imagen). Las bacterias eran primeras crecidas en una suspensión mediana. La suspensión entonces fue vaciada sobre una diapositiva de cristal por algunas horas para que las bacterias crezcan a un adherente del biofilm al cristal. La diapositiva de cristal entonces fue enjuagada con el media del cultivo celular y reflejado en el mismo media. El voladizo usado en esta medición es una Bio-Palanca los 60¦Ìm larga de Olympus (visible como sombra oscura en la imagen del brightfield).

Aplicaciones

Hay muchos ejemplos de aplicación del AFM y del ¨C del epifluorescence Cerca del Campo Que Explora métodos Internos Ópticos del Microscopio (NSOM), confocales, Totales de la Reflexión (TIRF) de la Fluorescencia, y de Resonancia de la Fluorescencia de Energía (FRET) de la Transferencia. Los Investigadores pueden ser referidos al riesgo de modificar la conformación del espécimen con el fluorocromo, así ligeramente comprometiendo el AFM también. Sin Embargo, está etiqueta el técnica que disminuye este problema. Una técnica es insertar un aminoácido modificado y fluorescente en una proteína (tal como inserción methylglyoxal en colágeno). Muchos experimentos no presentan esta edición en absoluto, determinado cuando el AFM se utiliza para accionar mecánicamente un espécimen y no a la imagen él.

Epifluorescence y AFM

  • Proteínas de Etiqueta u otros componentes en una membrana celular. Epifluorescence se utiliza para situar la membrana ópticamente y el AFM se utiliza para obtener una imagen de molecularidad elevada de la resolución (tal y como se muestra en del Cuadro 4) o de las propiedades mecánicas de la dimensión de las muestras (véase el Cuadro 5).
  • Ciertos lípidos de Etiqueta (como DPPC) para estudiar la fluidez de la membrana celular por las imágenes de FM que correlacionan y del AFM.
  • Estudiando la composición y la distribución de lípidos en vesículas con epifluorescence y usar el AFM simultáneo de obtener datos sobre las propiedades mecánicas y viscoelásticas de las mismas vesículas.
  • Estudiando la estructura de cromóforos, como los carotenoides y la clorofila, en relación a su comportamiento óptico.
  • Excite Mecánicamente una célula o aún algunos receptores en la superficie de una membrana celular con el AFM y usar FM ópticamente de seguir una cascada accionada de reacciones bioquímicas, como Ca2+ fluyen dentro de la célula.

El Cuadro 5. (Parte Superior) La imagen óptica fue utilizado para situar las bacterias y para colocar el voladizo. Las mediciones de la Fuerza entonces fueron hechas en las bacterias para evaluar el endurecimiento de la célula (imagen inferior). La muestra es Pseudomonas Aeruginosa que muestra GFP. En las curvas de la fuerza, la curva azul corresponde a la desviación del voladizo cuando se está replegando de la superficie, y la curva roja corresponde a la desviación mientras que se está acercando a la superficie. Compare la curva de la fuerza tomada en las bacterias a ésa en un substrato de cristal. La característica más llamativa es la adherencia grande (visible como desviación negativa en la curva azul de la contracción). Muestree la cortesía de Terry Beveridge, Universidad de Guelph, Canadá.

TRASTE y AFM

El TRASTE se utiliza para medir relaciones de la proximidad en proteínas, ácidos nucléicos, y membranas. Usando un método del TRASTE, es posible estudiar la acción recíproca dinámica de cambios en la conformación como la DNA, o molecular entre dos entidades. El AFM se puede utilizar simultáneamente para visualizar estas acciones.

NSOM y AFM

La proyección de imagen Simultánea del AFM y de NSOM de células permiso proyección de imagen topográfica y la determinación de las propiedades elásticos de la membrana.

TIRF y AFM

Esta técnica se puede utilizar para estudiar la reacción de células a las fuerzas localizadas aplicadas vía el voladizo en la parte superior de las células. Más generalmente, se utiliza para manipular las células en el nivel del nanómetro con la antena del AFM usada para seguir la reacción de la célula con fluorescencia.

Conclusión

El MFP-3D-BIO de la Investigación del Asilo es el instrumento de la opción para las mediciones simultáneas del AFM y de la fluorescencia. Su diseño único permite que estas mediciones sean hechas fácilmente y exacto. Simple alterando la preparación normal de la muestra del AFM, los investigadores pueden realizar estas mediciones y ensanchar sus experimentos a un número ilimitado de aplicaciones de la ciencia biológica.

Fuente: Investigación del Asilo

Para más información sobre esta fuente visite por favor la Investigación del Asilo

Date Added: Jul 26, 2006 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 09:53

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