Force Atomique Simultanée et Microscopie à Fluorescence Utilisant le MFP-3D AFM De la Recherche d'Asile

Sujets Couverts

Mouvement Propre
Combinaison de la Microscopie et de la Microscopie à Fluorescence Atomiques de Force
Conditions d'Instrumentation
Description et Installation
Préparation des Échantillons
Exemples d'Image
Applications
Epifluorescence et AFM
FRETTE et AFM
NSOM et AFM
TIRF et AFM
Conclusion

Mouvement Propre

La Combinaison de la Microscopie et de la microscopie à fluorescence (AFM) Atomiques de Force (FM) a longtemps été d'intérêt pour des biologistes. Ces deux types de microscopes fournissent individuellement de seules informations au sujet des échantillons.

Combinaison de la Microscopie et de la Microscopie à Fluorescence Atomiques de Force

La Microscopie à fluorescence est type employée pour trouver les molécules particulières. Cependant, cette technique de microscopie a fréquemment un certain nombre d'inconvénients comprenant la résolution spatiale limitée et la préparation des échantillons complexe. Une Autre limitation de cette microscopie est que la molécule doit être liée au fluorochrome, qui consécutivement, peut modifier la condition de la molécule.

d'autre part, l'AFM est une mesure effectuée avec un encorbellement qui est croix balayée la surface.

Le Schéma 1. Les MFP-3D - BIO permet des mesures simultanées optiques et d'AFM sur un microsope optique inversé, idéal pour des applications de biosciences.

Elles fournissent la définition moléculaire en trois dimensions des molécules biologiques sans l'agent contrastant supplémentaire (tel que le fluorochrome, les teintures, Etc.) ou de la compromission à l'échantillon. De plus, l'AFM est également une mesure plus de haute résolution qui est non-passagère.

Utilisant cette microscopie les techniques fournit simultanément à l'utilisateur la représentation de haute résolution sur les molécules particulières et ouvre également la trappe à une grande variété d'expériences de recherches. En cet article, nous décrirons l'instrumentation et l'installation, préparation des échantillons, applications, et donnons des exemples expérimentaux de la technique.

Conditions d'Instrumentation

Les mesures simultanées Réussies d'AFM et de FM exigent des configurations particulières des deux instruments. En premier lieu, l'AFM ne doit pas gêner la mesure de FM. Puisqu'on ne peut pas observer la plupart des diodes lasers rouges d'utilisation commerciale d'AFMs pour illuminer et trouver le fléchissement de l'encorbellement, les longueurs d'onde fluorescentes. Cependant, la Recherche MFP-3D d'Asile utilise une diode superluminescent infrarouge avec des longueurs d'onde fluorescentes réduites d'émission tout au plus. Ceci permet le visionnement de la fluorescence et de l'image d'AFM (voir le Schéma 2).

Le Schéma 2. Excitation de Fluorochrome /Emission (bleu) (rouge) et longueur d'onde de lumière de MFP-3D SLD.

De plus, les deux mesures ont des contraintes spatiales potentiellement contradictoires. Le microscope de FM exige que l'échantillon soit proche des objectifs de microscope inversé. Pour l'AFM, l'encorbellement doit également demeurer près de l'échantillon pour la représentation. Le MFP-3D est conçu particulièrement de sorte que l'échantillon puisse être consulté au microscope optique inversé et au stade de lecture de l'AFM.

Le balayeur de MFP-3D pose sur le haut d'un microscope inversé et fournit l'accès optique presque illimité à l'échantillon de dessous, le rendant facile à combiner avec des microscopes de fluorescence, y compris l'epifluorescence, confocal, le TIRF et la FRETTE.

Description et Installation

Le MFP-3D-BIO AFM est l'instrument idéal pour exécuter les mesures simultanées. Ce modèle a une embase et un balayeur DE X/Y qui posent sur un microscope optique inversé (fabriqué par Olympe, Zeiss ou Nikon). Cet arrangement de stade et de balayeur permet le cadrage simple de l'extrémité d'AFM avec l'axe optique et positionner submicronique de l'échantillon dans deux cotes. Il est également compatible avec tous les objectifs optiques inversés comprenant l'ouverture numérique élevée 100X et les objectifs de TIRF. Le Schéma 1 affiche une installation du MFP-3D-BIO monté sur un Nikon TE2000-E équipée pour la fluorescence.

Lors du fonctionnement, l'infrared SLD de MFP-3D AFM émet entre 840 et 880nm. Puisque la plupart des fluorophores ont des longueurs d'onde d'excitation et d'émission ci-dessous ces valeurs, il n'y a aucune interférence (voir le Schéma 2).

Préparation des Échantillons

La préparation des échantillons pour des mesures simultanées est assimilée à cela utilisée pour la représentation d'AFM. Cependant, dans la microscopie à fluorescence, les signes légers peuvent être faibles. Quelques méthodes classiques d'augmenter l'efficience des émissions fluorescentes ne peuvent pas être utilisées dans le MFP-3D parce qu'il empêcherait la sonde d'AFM d'entrer en contact avec le ¨C témoin par exemple, utilisant un support hydrophobe et remplacer l'eau par le glycérol, ou ajouter des antioxydants, pour augmenter l'efficience de la fluorescence.

Ces méthodes exigent type qu'une lamelle soit mise sur l'échantillon pour le protéger et préserver. Puisqu'une telle lamelle empêche la sonde d'AFM d'agir l'un sur l'autre avec l'échantillon, cette phase en préparation la préparation des échantillons doit être manquée. Au Lieu De Cela, la préparation doit être conçue en fonction chaque échantillon et la quantité de teinture fluorescente doit être adaptée aux conditions neufs de représentation. Par exemple, il pourrait être nécessaire d'augmenter la quantité de fluorochrome qui va gripper au spécimen pour obtenir un plus grand signe pour la mesure de FM. La Note, cependant, que puisque ceci peut avoir comme conséquence une perte de spécificité obligatoire de la teinture, et une compromission peut devoir être trouvée.

Exemples d'Image

Le Schéma 3 affiche la localisation des filaments d'actine relativement à la topographie extérieure des cellules utilisant un TIRFM/AFM combiné. Des cellules hela ont été développées sur les lamelles en verre de microscope, formaline-fixe, permeabilized avec Triton X-100, étiquetées avec TRITC-phalloidin, lavées avec de l'acétone et séchées. La Représentation a été effectuée utilisant une combinaison sur commande du MFP-3D AFM et un microscope de TIRF construit sur un microscope d'Olympe IX81. Des données Topographiques et de fluorescence ont été rassemblées simultanément. Des données Topographiques ont été saisies en mode de non contact utilisant un encorbellement de Péché (Olympe AC160). L'image affiche la voie de transmission de données de TIRF recouverte sur la topographie rendue d'AFM.

Le Schéma 3. données de TIRF recouvertes sur la topographie rendue d'AFM des Cellules Hela. Groupe d'accueil d'Image Miklós S.Z. Kellermayer, de Nanobiotechnologie et de Biophysique d'Unique-Molécule, Université de Pécs, Hongrie.

Le Schéma 4 affiche un exemple d'une cellule épithéliale. Ces images ont été prises avec un objectif à immersion dans l'huile de fluor de 100X Nikon S. L'image grise est une image de brightfield avec une certaine lumière blanche supplémentaire illuminant la région d'échantillon. Ceci permet à l'encorbellement (COURANT ALTERNATIF 240 d'Olympe) d'être aussi bien conçu. La deuxième image dans la séquence est l'image de fluorescence. La troisième image est l'image d'AFM du même mode rentré par cellule À C.A. Vous pouvez également voir le zoom de la zone particulière dans la région de cellules.

Le Schéma 4. (a) contraste optique de phase, (b) fluorescence, (c) AFM, et (d) AFM/fluorescence des fibroblastes humains fixes de poumon, échographie combiné de 60µm.

Le Schéma 5 est une image optique des bactéries (Pseudomonas aeruginosa) montrant une Protéine Fluorescente Verte (GFP) et des courbures correspondantes de force. L'image a été prise avec un 10X objectif et a utilisé un filtre fluorescent de cube en Nikon FITCHYQ. La lumière Blanche d'une source de fibre a été également employée pour illuminer l'encorbellement (visible du côté gauche de l'image). Les bactéries étaient des premières développées dans une suspension moyenne. La suspension a été alors vidée au-dessus d'une lamelle de verre pendant quelques heures pour que les bactéries élèvent un adhérent de film biologique à la glace. La lamelle de verre était alors rincée avec le support de culture cellulaire et imagée dans le même support. L'encorbellement utilisé dans cette mesure est une 60¦Ìm longue Bio-Manette d'Olympe (visible comme ombre sombre dans l'image de brightfield).

Applications

Il y a beaucoup d'exemples d'application d'AFM et de ¨C d'epifluorescence Près de la Zone Balayant des méthodes Internes du Microscope (NSOM), confocales, Totales Optiques de Réflectivité (TIRF) de Fluorescence, et de Résonance de Fluorescence (FRET) de Transfert d'Énergie. Des Chercheurs peuvent être concernés avec le risque de modifier la conformation du spécimen par du fluorochrome, de ce fait légèrement compromettant l'AFM aussi bien. Cependant, là étiquettent les techniques qui réduisent à un minimum ce problème. Une technique est d'insérer un acide aminé modifié et fluorescent dans une protéine (telle que l'insertion methylglyoxal en collagène). Beaucoup d'expériences ne présentent pas cette délivrance du tout, en particulier quand l'AFM est employé pour déclencher mécaniquement un spécimen et pas à l'image il.

Epifluorescence et AFM

  • Protéines de Écriture De Labels ou d'autres composants sur une membrane cellulaire. Epifluorescence est employé pour plac la membrane optiquement et l'AFM est employé pour obtenir une image de grande molécularité de définition (suivant les indications du Schéma 4) ou des propriétés mécaniques de mesure des échantillons (voir le Schéma 5).
  • Certains lipides de Écriture De Labels (comme DPPC) pour étudier la fluidité de la membrane cellulaire par des images marquantes de FM et d'AFM.
  • Étudiant la composition et la distribution des lipides dans des vésicules l'epifluorescence et en employant l'AFM simultané d'obtenir des données au sujet des propriétés mécaniques et visco-élastiques des mêmes vésicules.
  • Étudiant la structure des chromophores, comme les caroténoïdes et la chlorophylle, par rapport à leur comportement optique.
  • Excitez Mécaniquement une cellule ou même quelques récepteurs sur la surface d'une membrane cellulaire avec l'AFM et employer FM de suivre optiquement une cascade déclenchée de réactions biochimiques, comme Ca2+ circulent à l'intérieur de la cellule.

Le Schéma 5. (Haut) L'image optique a été employé pour plac les bactéries et pour positionner l'encorbellement. Des mesures de Force ont été alors effectuées sur les bactéries pour évaluer la dureté de la cellule (image inférieure). L'échantillon est des Pseudomonas aeruginosa affichant le GFP. Dans les courbures de force, la courbure bleue correspond au fléchissement de l'encorbellement quand elle est retirée de la surface, et la courbure rouge correspond au fléchissement pendant qu'elle approche la surface. Comparez la courbure de force prise sur les bactéries à celle sur un substrat en verre. La caractéristique technique la plus saisissante est la grande adhérence (visible comme fléchissement négatif sur la courbure bleue de rétraction). Échantillonnez l'accueil de Terry Beveridge, Université de Guelph, Canada.

FRETTE et AFM

La FRETTE est utilisée pour mesurer des rapports de proximité dans les protéines, les acides nucléiques, et des membranes. Suivre une méthode de FRETTE, il est possible d'étudier le dynamique des changements de la conformation comme l'ADN, ou l'interaction moléculaire entre deux entités. L'AFM peut être employé simultanément pour concevoir ces événements.

NSOM et AFM

La représentation Simultanée d'AFM et de NSOM des cellules permettent la représentation topographique et la détermination des propriétés élastiques de la membrane.

TIRF et AFM

Cette technique peut être employée pour étudier la réaction des cellules aux forces localisées appliquées par l'intermédiaire de l'encorbellement sur le haut des cellules. Plus généralement, elle est employée pour manipuler des cellules au niveau de nanomètre avec la sonde d'AFM employée pour suivre la réaction de cellules avec la fluorescence.

Conclusion

Le MFP-3D-BIO de la Recherche d'Asile est l'instrument du choix pour des mesures simultanées d'AFM et de fluorescence. Son seul design permet à ces mesures d'être effectuées facilement et avec précision. En modifiant simplement la préparation des échantillons normale d'AFM, les chercheurs peuvent exécuter ces mesures et élargir leurs expériences à un numéro sans limites des applications de biosciences.

Source : Recherche d'Asile

Pour plus d'informations sur cette source visitez s'il vous plaît la Recherche d'Asile

Date Added: Jul 26, 2006 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 09:23

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