Forza e Microscopia di Fluorescenza Atomiche Simultanee Facendo Uso del MFP-3D AFM Da Ricerca dell'Asilo

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Sfondo
Combinazione Microscopia Atomica della Forza e della Microscopia di Fluorescenza
Requisiti di Strumentazione
Descrizione ed Impostazione
Preparato del Campione
Esempi di Immagine
Applicazioni
Epifluorescence ed AFM
CERCHIO ed AFM
NSOM ed AFM
TIRF ed AFM
Conclusione

Sfondo

La Combinazione la Microscopia Atomica della Forza (AFM) e della microscopia di fluorescenza (FM) lungamente è stata di interesse per i biologi. Questi due tipi di microscopi forniscono determinato informazioni uniche sui campioni.

Combinazione Microscopia Atomica della Forza e della Microscopia di Fluorescenza

La microscopia di Fluorescenza è usata tipicamente per individuare le molecole specifiche. Tuttavia, questa tecnica di microscopia ha frequentemente una serie di svantaggi compreso risoluzione spaziale limitata ed il preparato complesso del campione. Un'Altra limitazione di questa microscopia è che la molecola deve essere limitata al fluorocromo, che a sua volta, può alterare lo stato della molecola.

d'altra parte, il AFM è una misura effettuata con una trave a mensola che è incrocio scandito la superficie.

Figura 1. I MFP-3D - BIO- permette le misure simultanee del AFM ed ottiche su un microsope ottico invertito, ideale per le applicazioni di scienze biologiche.

Forniscono la risoluzione molecolare tridimensionale delle molecole biologiche senza l'agente di contrapposizione supplementare (quali il fluorocromo, le tinture, Ecc.) o del compromesso al campione. Inoltre, il AFM è egualmente una misura più di alta risoluzione che è non momentanea.

Facendo Uso di questa microscopia tecniche fornisce simultaneamente all'utente la rappresentazione di alta risoluzione sulle molecole specifiche ed egualmente apre la porta ad un'ampia varietà di esperimenti della ricerca. In questo articolo, descriveremo la strumentazione e l'impostazione, il preparato del campione, le applicazioni e forniamo gli esempi sperimentali della tecnica.

Requisiti di Strumentazione

Le Riuscite misure simultanee di FM e del AFM richiedono le configurazioni specifiche di entrambi gli strumenti. In primo luogo, il AFM non deve interferire con la misura di FM. Poiché la maggior parte dei diodi laser rossi di uso commerciale di AFMs per illuminare ed individuare la deformazione della trave a mensola, le lunghezze d'onda fluorescenti non possono essere osservati. Tuttavia, la Ricerca MFP-3D dell'Asilo utilizza un diodo superluminescent infrarosso con le lunghezze d'onda fluorescenti diminuite dell'emissione al massimo. Ciò permette l'esame sia della fluorescenza che dell'immagine del AFM (si veda Figura 2).

Figura 2. Eccitazione del Fluorocromo /Emission (blu) (rosso) e lunghezza d'onda dell'indicatore luminoso di MFP-3D SLD.

Inoltre, entrambe le misure hanno vincoli spaziali potenzialmente contrastanti. Il microscopio di FM richiede che il campione sia vicino agli obiettivi del microscopio invertito. Per il AFM, la trave a mensola deve anche risiedere vicino al campione per la rappresentazione. Il MFP-3D è progettato specificamente in moda da potere raggiungere il campione sia dal microscopio ottico invertito che dalla fase di scansione del AFM.

Lo scanner di MFP-3D riposa sulla cima di un microscopio invertito e consente l'accesso ottico quasi illimitato al campione da sotto, rendendolo facile combinarsi con i microscopi di fluorescenza, compreso il epifluorescence, confocale, TIRF ed il CERCHIO.

Descrizione ed Impostazione

Il MFP-3D-BIO AFM è lo strumento ideale per realizzare le misure simultanee. Questo modello ha una base di appoggio e uno scanner DI X-Y che riposano sopra un microscopio ottico invertito (fabbricato da Olympus, da Zeiss o da Nikon). Questa disposizione dello scanner e della fase permette sia l'allineamento semplice del suggerimento del AFM con il posizionamento di submicron che di asse ottico del campione in due dimensioni. È egualmente compatibile con tutti gli obiettivi ottici invertiti compreso l'alta apertura diaframma numerica 100X e gli obiettivi di TIRF. Figura 1 mostra un'impostazione del MFP-3D-BIO montato su un Nikon TE2000-E fornita per la fluorescenza.

Durante il funzionamento, l'infrarosso SLD di MFP-3D AFM emette fra 840 e 880nm. Poiché la maggior parte dei fluorophores hanno lunghezze d'onda dell'emissione e di eccitazione sotto questi valori, non c'è interferenza (si veda Figura 2).

Campioni il Preparato

Il preparato del campione per le misure simultanee è simile a quello usato per la rappresentazione del AFM. Tuttavia, nella microscopia di fluorescenza, i segnali luminosi possono essere deboli. Alcuni metodi comuni di aumento del risparmio di temi delle emissioni fluorescenti non possono essere utilizzati nel MFP-3D perché impedirebbe la sonda del AFM entr inare contatto con il ¨C del campione per esempio, facendo uso di un media idrofobo e della sostituzione dell'acqua con il glicerolo, o dell'aggiunta degli antiossidanti, per aumentare il risparmio di temi della fluorescenza.

Questi metodi richiedono tipicamente che una lamella sia collocata sopra il campione per proteggerla e conservare. Poiché una tal lamella impedisce la sonda del AFM l'interazione con il campione, questo punto nel preparato del campione deve essere omesso. Invece, il preparato deve essere adeguato a ogni campione e la quantità di tintura fluorescente deve adattarsi ai nuovi stati della rappresentazione. Per esempio, potrebbe essere necessario da aumentare la quantità di fluorocromo che sta andando legare all'esemplare per ottenere un più grande segnale per la misura di FM. La Nota, tuttavia, che poiché questa può provocare una perdita di specificità obbligatoria della tintura e un compromesso può avere bisogno di di essere trovato.

Esempi di Immagine

Figura 3 mostra la localizzazione dei filamenti dell'actina riguardante la topografia di superficie degli unicellulari facendo uso di un TIRFM/AFM combinato. Le celle HeLa si sono sviluppate sulle lamelle di vetro del microscopio, formalina-fisso, permeabilized con Tritone X-100, sono state contrassegnate con TRITC-phalloidin, sono state lavate con l'acetone e sono state asciugate. La Rappresentazione è stata effettuata facendo uso di una combinazione su misura del MFP-3D AFM e un microscopio di TIRF costruito su un microscopio di Olympus IX81. I dati della fluorescenza e Topografici sono stati raccolti simultaneamente. I dati Topografici si sono acquistati nel modo senza contatto facendo uso di una trave a mensola di Peccato (Olympus AC160). L'immagine mostra il canale di dati di TIRF sovrapposto sulla topografia resa del AFM.

Figura 3. dati di TIRF sovrapposti su topografia resa del AFM delle Celle HeLa. Gruppo di cortesia di Immagine Miklós S.Z. Kellermayer, di Nanobiotecnologia e di Biofisica della Unico Molecola, Università di Pécs, Ungheria.

Figura 4 mostra un esempio di una cella epiteliale. Queste immagini sono state catturate con un obiettivo d'immersione in olio del fluor di 100X Nikon S. L'immagine grigia è un'immagine del brightfield con una certa luce bianca supplementare che illumina la regione del campione. Ciò permette che la trave a mensola (CA 240 di Olympus) sia visualizzata pure. La seconda immagine nella sequenza è l'immagine della fluorescenza. La terza immagine è l'immagine del AFM dello stesso modo di CA contenuto cella. Potete inoltre vedere lo zoom dell'area specifica all'interno della regione delle cellule.

Figura 4. (A) contrasto ottico di fase, (B) fluorescenza, (C) AFM e (D) ha combinato AFM/fluorescence dei fibroblasti umani fissi del polmone, scansione di 60µm.

Figura 5 è un'immagine ottica dei batteri (Pseudomonas Aeruginosa) che mostrano una Proteina Fluorescente Verde (GFP) e le curve corrispondenti della forza. L'immagine è stata catturata con un 10X obiettivo ed ha utilizzato un filtro correttore per luce fluorescente dal cubo di Nikon FITCHYQ. La Luce bianca da una sorgente della fibra egualmente è stata usata per illuminare la trave a mensola (visibile sul lato sinistro dell'immagine). I batteri erano primi sviluppati in una sospensione media. La sospensione poi è stata arrossita sopra una lastra di vetro per alcune ore in modo che i batteri per coltivare un aderente del biofilm a vetro. La lastra di vetro poi è stata risciacquata con il media della coltura cellulare ed imaged nello stesso media. La trave a mensola utilizzata in questa misura è una Bio--Leva lunga 60¦Ìm di Olympus (visibile come ombra scura nell'immagine del brightfield).

Applicazioni

Ci sono molti esempi di applicazione del AFM e del ¨C di epifluorescence Vicino al Campo che Scandisce i metodi Interni confocali e Totali Ottici del Microscopio (NSOM), di Riflessione (TIRF) della Fluorescenza e di Risonanza della Fluorescenza di Energia (FRET) di Trasferimento. I Ricercatori possono preoccuparsi del rischio di modificazione della conformazione dell'esemplare con il fluorocromo, così leggermente compromettendo il AFM pure. Tuttavia, sta contrassegnando le tecniche che minimizzano questo problema. Una tecnica è di inserire un amminoacido modificato e fluorescente in una proteina (come inserimento methylglyoxal in collageno). Molti esperimenti non presentano questa emissione affatto, specialmente quando il AFM è usato per avviare meccanicamente un esemplare e non all'immagine.

Epifluorescence ed AFM

  • Proteine di Contrassegno o altre componenti su una membrana cellulare. Epifluorescence è usato per posizionare la membrana otticamente ed il AFM è usato per ottenere un'immagine di grande molecolarità di risoluzione (secondo le indicazioni di Figura 4) o dei beni meccanici di misura dei campioni (si veda Figura 5).
  • Lipidi determinati di Contrassegno (come DPPC) per studiare la fluidità della membrana cellulare dalle immagini di correlazione del AFM e di FM.
  • Studiando la composizione e la distribuzione dei lipidi in vescicole through il epifluorescence ed usando AFM simultaneo ottenere i dati circa i beni meccanici e viscoelastici delle stesse vescicole.
  • Studiando la struttura dei cromofori, come i carotenoidi e la clorofilla, relativamente al loro comportamento ottico.
  • Ecciti Meccanicamente una cella o persino alcuni ricevitori alla superficie di una membrana cellulare con il AFM ed usando FM otticamente seguire una cascata avviata delle reazioni biochimiche, come Ca2+ scorrono dentro la cella.

Figura 5. (Cima) L'immagine ottica è stata usata per posizionare i batteri e per posizionare la trave a mensola. Le misure della Forza poi sono state effettuate sui batteri per valutare la durezza della cella (immagine inferiore). Il campione è Pseudomonas Aeruginosa che mostra GFP. Nelle curve della forza, la curva blu corrisponde alla deformazione della trave a mensola quando sta ritiranda dalla superficie e la curva rossa corrisponde alla deformazione mentre sta avvicinandosi alla superficie. Confronti la curva della forza catturata sui batteri a quella su un substrato di vetro. La funzionalità più notevole è la grande aderenza (visibile come deformazione negativa sulla curva blu di ritrazione). Campioni la cortesia di Terry Beveridge, Università di Guelfo, Canada.

CERCHIO ed AFM

Il CERCHIO è utilizzato per la misurazione delle relazioni di prossimità in proteine, in acidi nucleici ed in membrane. Facendo Uso di un metodo del CERCHIO, è possibile studiare l'interazione dinamica dei cambiamenti nella conformazione come DNA e o molecolare fra due entità. Il AFM può essere usato simultaneamente per prevedere questi eventi.

NSOM ed AFM

La rappresentazione Simultanea di NSOM e del AFM delle celle permette la rappresentazione topografica e la determinazione dei beni elastici della membrana.

TIRF ed AFM

Questa tecnica può essere usata per studiare la risposta delle celle alle forze localizzate applicate tramite trave a mensola sulla cima delle celle. Più generalmente, è usata per manipolare le celle al livello di nanometro con la sonda del AFM usata per seguire la reazione delle cellule con la fluorescenza.

Conclusione

Il MFP-3D-BIO dalla Ricerca dell'Asilo è lo strumento della scelta per le misure simultanee della fluorescenza e del AFM. La Sua progettazione unica permette che queste misure siano effettuate facilmente e precisamente. Semplicemente alterando il preparato normale del campione del AFM, i ricercatori possono realizzare queste misure ed estendere i loro esperimenti ad un numero illimitato delle applicazioni di scienze biologiche.

Sorgente: Ricerca dell'Asilo

Per ulteriori informazioni su questa sorgente visualizzi prego la Ricerca dell'Asilo

Date Added: Jul 26, 2006 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 09:29

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