保護所の研究からの MFP-3D AFM を使用して同時原子力そして蛍光顕微鏡

カバーされるトピック

背景
原子力の顕微鏡検査および蛍光顕微鏡の結合
器械使用の条件
記述およびセットアップ
サンプル準備
画像の例
アプリケーション
Epifluorescence および AFM
焦燥および AFM
NSOM および AFM
TIRF および AFM
結論

背景

原子力の顕微鏡検査および (AFM)蛍光顕微鏡を結合することは (FM)生物学者のための興味長くでした。 これら二つのタイプの顕微鏡はそれぞれサンプルについての一義的な情報を提供します。

原子力の顕微鏡検査および蛍光顕微鏡の結合

蛍光顕微鏡が普通特定の分子を検出するのに使用されています。 ただし、この顕微鏡検査の技術に頻繁に限られた空間分解能および複雑なサンプル準備を含むいくつかの欠点があります。 この顕微鏡検査のもう一つの限定は、分子の状態を変えることができます分子が次々と螢光色素に区切られなければならないことです。

一方では、 AFM はスキャンされた十字表面の片持梁によってなされる測定です。

図 1。 MFP-3D - 生物生物科学アプリケーションにとって理想的な逆にされた光学 microsope の同時光学および AFM の測定を許可します。

それは追加対照的なエージェント無しでサンプルに生物的分子 (螢光色素、染料、等のような) または暗号漏洩の三次元分子解像度を提供します。 さらに、 AFM はまた非つかの間の高リゾリューションの測定です。

これらの顕微鏡検査を使用して技術は特定の分子で高リゾリューションイメージ投射を同時にユーザーに与え、またいろいろ研究の実験にドアを開きます。 この記事では、私達は器械使用およびセットアップのサンプル準備、アプリケーションを記述し、技術の実験例を与えます。

器械使用の条件

正常な同時 AFM および FM の測定は両方の器械の特定の構成を必要とします。 まず第一に、 AFM は FM の測定と干渉してはなりません。 片持梁の偏向を照らし、検出するほとんどの AFMs の商業使用の赤い半導体レーザーが蛍光波長観察することができないので。 ただし、保護所の研究 MFP-3D は減らされた放出蛍光波長の赤外線 superluminescent ダイオードを最高で使用します。 これは蛍光性および AFM の画像両方の見ることを可能にします (図 2) を見て下さい。

図 2. 螢光色素の刺激 (青い) /Emission (赤い) および MFP-3D SLD ライト波長。

さらに、測定に両方とも可能性としては矛盾した空間的な抑制があります。 FM の顕微鏡はサンプルが逆にされた顕微鏡の目的に近いことを必要とします。 AFM のために、片持梁はまたイメージ投射のためのサンプルの近くに存在しなければなりません。 MFP-3D はサンプルが AFM の逆にされた光学顕微鏡そしてスキャンの段階によって両方アクセスすることができるようにとりわけ設計されています。

MFP-3D のスキャンナーは逆にされた顕微鏡の上で休み、サンプルへのほとんど無制限の光学アクセスを下方から提供しま、 epifluorescence、共焦点、 TIRF および焦燥を含むけい光顕微鏡によって、結合することを容易にします。

記述およびセットアップ

MFP-3D-BIO AFM は同時測定を行う理想的な器械です。 このモデルに逆にされた光学顕微鏡の上に休む X-Y スキャンナーおよび支承板があります (オリンパス、ツァイスまたは Nikon 著製造された)。 この段階およびスキャンナーの整理は光軸の AFM の先端の簡単なアラインメントおよび 2 つの次元のサンプルのミクロ以下の位置を両方可能にします。 それは高い開口数 100X および TIRF の目的を含むあらゆる逆にされた光学目的とまた互換性があります。 図 1 は蛍光性のために装備されている Nikon TE2000-E に取付けられる MFP-3D-BIO のセットアップを示します。

操作の間に、 MFP-3D AFM 赤外線 SLD は 840 と 880nm の間で出ます。 ほとんどの fluorophores にこれらの値の下で刺激および放出波長があるので、干渉がありません (図 2) を見て下さい。

準備を見本抽出して下さい

同時測定のためのサンプル準備は AFM イメージ投射に使用するそれに類似しています。 ただし、蛍光顕微鏡に、光信号はかすかである場合もあります。 蛍光放出の効率を高めるある共通方法は MFP-3D でグリセロールと疎水性媒体および水を取り替えるか、または蛍光性の効率を高めるために酸化防止剤を追加することを使用して AFM のプローブは例えばサンプル ¨C が付いている接触に入って来ることを防ぐので、使用することができません。

これらの方法は普通それを保護し、維持するために coverslip がサンプルの上に置かれることを必要とします。 AFM のプローブはサンプルと相互に作用していることをそのような coverslip が防ぐので、サンプル準備のこのステップは省略されなければなりません。 その代り、準備は各サンプルに合わなければなり、蛍光染料の量は新しいイメージ投射状態に適応しなければなりません。 例えば、 FM の測定のためのより大きいシグナルを得るために標本に結合しようとしている螢光色素の量を増加することは必要であるかもしれません。 しかしこれが染料の結合の特定性の損失、および暗号漏洩で起因するかもしれないのでノートはこと見つけられる必要がある場合もあります。

画像の例

図 3 は結合された TIRFM/AFM を使用して単一セルの表面の地形に関連してアクチンフィラメントのローカリゼーションを示します。 ヒーラセルはガラス顕微鏡の coverslips で、ホルマリン固定育ち、トリトン X-100 と permeabilized、 TRITC-phalloidin と分類され、アセトンと洗浄され、そして乾燥しました。 イメージ投射はオリンパス IX81 の顕微鏡で組み立てられた MFP-3D AFM および TIRF の顕微鏡の特注の組合せを使用して遂行されました。 地勢および蛍光性データは同時に集められました。 地勢データは罪の片持梁 (オリンパス AC160) を使用して無接触モードで得られました。 画像はされた AFM の地形でオーバーレイをされる TIRF のデータ・チャネルを示します。

オーバーレイをされるヒーラセルのされた AFM の地形の図 3. TIRF データ。 画像礼儀 Miklós S.Z. Kellermayer、 Nanobiotechnology および単一分子の生物物理学のグループ、 Pécs、ハンガリーの大学。

図 4 は上皮細胞の例を示します。 これらの画像はオイルの液浸 100X Nikon S の蛍光の目的と撮られました。 灰色の画像はサンプル領域を照らす追加白色光との brightfield の画像です。 これは片持梁 (オリンパス AC 240) がまた視覚化されるようにします。 シーケンスの第 2 画像は蛍光性の画像です。 第 3 画像は AC モードで取られる同じセルの AFM の画像です。 またセル領域内の特定地域のズームレンズを見ることができます。

図 4. (a) 光学段階の対照、 (b) 固定人間の肺繊維芽細胞の蛍光性、 (c) AFM および (d) 結合された AFM/fluorescence、 60µm スキャン。

図 5 は対応する緑の蛍光蛋白質および力のカーブを示している細菌 (緑膿菌) の (GFP)光学画像です。 画像は客観的な 10X と撮られ、 Nikon FITCHYQ の立方体蛍光フィルターを使用しました。 またファイバーソースからの白色光が片持梁を使用されました (画像の左側で目に見える) 照らすのに。 中型の中断で育った細菌は第 1 でした。 中断は少数の時間のスライドガラスにそれから biofilm の被着剤がガラスに細菌によってがなることができるようにフラッシュされました。 スライドガラスは細胞培養媒体でそれから同じ媒体で視覚化された洗われ。 この測定で使用される片持梁はオリンパスの 60¦Ìm 長い生物レバーです (brightfield の画像の濃い影として目に見える)。

アプリケーション

光学顕微鏡の (NSOM)、共焦点の、総内部反射率蛍光性および蛍光性の共鳴エネルギーの転送方法をスキャンするフィールドの近くに AFM および epifluorescence の (TIRF) ¨C の多くの適用例が (FRET)あります。 従って研究者は螢光色素が付いている標本の構造を修正する危険にかかわっているかもしれわずかに AFM をまた妥協します。 ただし、そこにこの問題を最小化する技術を分類しています。 1 つの技術は蛋白質で修正された蛍光アミノ酸を挿入することです (methylglyoxal コラーゲンの挿入のような)。 多くの実験は特に機械的に画像に標本をない誘発するのに AFM がそれ使用されているとき、この問題を全然示さないし。

Epifluorescence および AFM

  • 細胞膜の分類蛋白質か他のコンポーネント。 Epifluorescence が膜を光学的に取付けるのに使用され、高分子の解像度の画像を得るのに AFM が使用されています (図 4) かサンプルの測定の機械特性に示すように (図 5) を見て下さい。
  • 関連 FM および AFM の画像によって細胞膜の流動率を調査する分類のある特定の脂質 (DPPC のように)。
  • 小胞の脂質の構成そして分布を同じ小胞の機械および粘弾性がある特性についてのデータを得る epifluorescence および同時 AFM を使用することによって調査します。
  • 発色団の構造を、カロチノイドおよびクロロフィルのような、光学動作に関連して調査します。
  • 機械的にセルを刺激して下さい光学的に Ca2+ のような生化学的な反作用の誘発されたカスケードに、続くまた更に AFM および FM を使用することを用いる細胞膜の表面のある受容器はセルの中で流れます。

図 5. (上) が光学画像細菌を取付け、片持梁を置くのに使用されました。 力の測定は細菌でそれからセル (最下の画像) の硬度を査定するためになされました。 サンプルは GFP を示す緑膿菌です。 力のカーブでは、青いカーブは片持梁の偏向に表面に近づいていると同時に表面から撤回されている、赤いカーブは偏向に対応しますとき対応し。 細菌で取られるガラス基板のそれと力のカーブを比較して下さい。 顕著な特徴は大きい付着です (青い引き込みのカーブの否定的な偏向として目に見える)。 テリー Beveridge の Guelph、カナダの大学の礼儀を見本抽出して下さい。

焦燥および AFM

焦燥は蛋白質、核酸および膜で近さの関係を測定するために使用されます。 焦燥方法を使用して、 2 つのエンティティ間の DNA のような構造の変更のダイナミックな、か分子相互作用を調査することは可能です。 AFM がこれらのイベントを視覚化するのに同時に使用することができます。

NSOM および AFM

セルの同時 AFM および NSOM イメージ投射は膜の伸縮性がある特性の地勢イメージ投射そして決定を可能にします。

TIRF および AFM

この技術がセルの上の片持梁で加えられる集中させた力へのセルの応答を調査するのに使用することができます。 もっと一般に、蛍光性とセル反作用に続くことを使用される AFM のプローブが付いているナノメーターのレベルのセルを処理することを使用します。

結論

保護所の研究からの MFP-3D-BIO は同時 AFM および蛍光性の測定のための選択の器械です。 その一義的なデザインはこれらの測定が容易そして正確になされるようにします。 正常な AFM のサンプル準備を単に変えることによって、研究者はこれらの測定を行い、生物科学アプリケーションの無制限番号に彼らの実験を広げることができます。

ソース: 保護所の研究

このソースのより多くの情報のために保護所の研究を訪問して下さい

Date Added: Jul 26, 2006 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 09:32

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