보호 시설 연구에서 MFP-3D AFM를 사용하는 동시 원자 군대 그리고 형광 현미경 검사법

커버되는 토픽

배경
원자 군대 현미경 검사법 및 형광 현미경 검사법 결합
기계 사용 필수품
묘사와 준비
견본 준비
심상 보기
응용
Epifluorescence와 AFM
번민과 AFM
NSOM와 AFM
TIRF와 AFM
결론

배경

원자 군대 현미경 검사법 및 (AFM) 형광 현미경 검사법을 결합하는 것은 (FM) 생물학자를 위한 관심사의 오래 이었습니다. 현미경의 이러한 두 종류 모형은 개별적으로 견본에 관하여 유일한 정보를 제공합니다.

원자 군대 현미경 검사법 및 형광 현미경 검사법 결합

형광 현미경 검사법은 전형적으로 특정 분자를 검출하기 위하여 이용됩니다. 그러나, 이 현미경 검사법 기술에는 자주 한정된 공간적 해상도 및 복잡한 견본 준비를 포함하여 다수 결점이 있습니다. 이 현미경 검사법의 또 다른 제한은, 분자의 국가를 바꿀 수 있습니다 분자가 차례차례로 형광 색소에 바운스되어야 하다 입니다.

다른 한편으로는, AFM는 검사한 십자가 표면인 외팔보로 한 측정입니다.

숫자 1. MFP-3D - 생물 bioscience 응용에 대하 이상 거꾸로 한 광학적인 microsope에 동시 광학 적이고와 AFM 측정을 허용합니다.

그것은 추가 에이전트 없이 견본에 생물학 분자 (형광 색소 염료, 등등과 같은) 또는 타협의 3차원 분자 해결책을 제공합니다. 추가적으로, AFM는 또한 비 쏜살같은 고해상 측정입니다.

이 현미경 검사법을 사용하여 기술은 특정 분자에 고해상 화상 진찰을 동시에 사용자에게 제공하고 또한 다양한 연구 실험에 문을 엽니다. 이 약품에서는, 우리는 기계 사용 및 준비 의 견본 준비, 응용을 기술하고, 기술의 실험적인 예를 듭니다.

기계 사용 필수품

성공적인 동시 AFM와 FM 측정은 두 계기 전부의 특정 윤곽을 요구합니다. 맨먼저, AFM는 FM 측정과 충돌하면 안됩니다. 외팔보의 편향도를 분명히하고 검출하기 대부분의 AFMs 상업적인 사용 빨간 레이저 다이오드가, 형광성 파장 관찰되기 수 없기 때문에. 그러나, 보호 시설 연구 MFP-3D는 감소된 방출 형광성 파장을 가진 적외선 superluminescent 다이오드를 많아야 사용합니다. 이것은 형광 및 AFM 심상 둘 다의 전망을 허용합니다 (숫자 2)를 보십시오.

숫자 2. 형광 색소 흥분 ((빨간) 파란) /Emission 및 MFP-3D SLD 빛 파장.

추가적으로, 두 측정 다 잠재적으로 상반되는 공간 제한이 있습니다. FM 현미경은 견본이 거꾸로 한 현미경 목적에 가깝도록 요구합니다. AFM를 위해, 외팔보는 또한 화상 진찰을 위한 견본에 가깝게 거주해야 합니다. MFP-3D는 견본이 AFM의 거꾸로 한 광학적인 현미경 그리고 스캐닝 단계에 의해 둘 다 접근될 수 있다 그래야 특히 디자인됩니다.

MFP-3D 스캐너는 거꾸로 한 현미경의 상단에 휴식하고 견본에 거의 무제한 광학적인 접근을 아래쪽에서 제공해, epifluorescence, confocal, TIRF 및 번민을 포함하여 형광 현미경과, 결합하 것을 쉬운 하.

묘사와 준비

MFP-3D-BIO AFM는 동시 측정을 실행하는 이상적인 계기 입니다. 이 모형에는 (Olympus, Zeiss 또는 Nikon의 제조되는) 거꾸로 한 광학적인 현미경의 위에 휴식하는 X-Y 스캐너 및 기본 격판덮개 가 있습니다. 이 단계와 스캐너 배열은 광학 축선을 가진 AFM 끝의 간단한 줄맞춤 및 2개 차원에 있는 견본의 미크론 이하에게 두를 둘 다 허용합니다. 그것은 또한 높은 수 가늠구멍 100X 및 TIRF 목적을 포함하여 어떤 거꾸로 한 광학적인 목적든지와 호환이 됩니다. 숫자 1은 형광을 위해 갖춰진 Nikon TE2000-E에 거치된 MFP-3D-BIO의 준비를 보여줍니다.

작동 도중, MFP-3D AFM 적외선 SLD는 840와 880nm 사이에서 방출합니다. 대부분의 fluorophores에는 이 가치의 밑에 흥분과 방출 파장이 있기 때문에, 아무 방해도 없습니다 (숫자 2)를 보십시오.

준비를 간색하십시오

동시 측정을 위한 견본 준비는 AFM 화상 진찰에 사용된 그것과 유사합니다. 그러나, 형광 현미경 검사법에서, 광 신호는 감도불량할 수 있습니다. 형광성 방출의 효율성 증가의 몇몇 일반적인 방법은 MFP-3D에서 글리세롤로 소수성 매체 및 근해를 교환하거나, 형광의 효율성을 증가하기 위하여 산화 방지제 추가하기를 사용하여 예를 들면 견본 ¨C와의 접촉으로 오기에서 AFM 탐사기를 방지할 것이기 때문에, 사용될 수 없습니다.

이 방법은 전형적으로 그것을 보호하고 보존하기 위하여 coverslip가 견본의 위에 두도록 요구합니다. 그런 coverslip가 견본과 상호 작용에서 AFM 탐사기를 방지하기 때문에, 견본 준비에 있는 이 단계는 생략되어야 합니다. 대신, 준비는 각 견본에 맞추어져야 하고 형광성 염료 양은 새로운 화상 진찰 조건에 적응시켜야 합니다. 예를 들면, FM 측정을 위한 더 큰 신호를 장악하기 위하여 견본에 묶기 위하여 려고 하고 있는 형광 색소 양을 증가시키는 것이 필요할 것이 지도 모릅니다. 이것이 염료의 의무적인 특이성의 손실, 및 타협 귀착되기 수 있기 때문에 주는, 그러나, 찾아낼 필요가 있을 수도 있습니다.

심상 보기

숫자 3은 결합한 TIRFM/AFM를 사용하여 단세포의 지상 지세에 관련된 악틴 필라멘트의 지방화를 보여줍니다. HeLa 세포는 유리제 현미경 coverslips에, 포르말린 조정 증가되고, 트라이톤 X-100로 permeabilized, TRITC-phalloidin로 레테르를 붙이고, 아세톤으로 세척되고 말려짔습니다. 화상 진찰은 Olympus IX81 현미경에 구성된 MFP-3D AFM와 TIRF 현미경의 주문품 조합을 사용하여 실행되었습니다. 지형도 작성과 형광 데이터는 동시에 집합되었습니다. 지형도 작성 데이터는 죄악 외팔보 (Olympus AC160)를 사용하여 비접촉형에서 취득되었습니다. 심상은 만들어진 AFM 지세에 입힌 TIRF 자료 채널을 보여줍니다.

입히는 HeLa 세포의 만들어진 AFM 지세에 숫자 3. TIRF 데이터. 심상 의례 Miklós S.Z. Kellermayer, Nanobiotechnology 및 단 하나 분자 생물물리학 단, Pécs, 헝가리의 대학.

숫자 4는 상피 세포의 보기를 보여줍니다. 이 심상은 기름 침수 100X Nikon S fluor 목적으로 취했습니다. 회색 심상은 견본 지구를 분명히하는 약간 추가 공정한 판단을 가진 brightfield 심상입니다. 이것은 외팔보 (Olympus AC 240)가 또한 구상되는 것을 허용합니다. 순서에 있는 두번째 심상은 형광 심상입니다. 제 3 의 심상은 AC 최빈값에서 취한 동일 세포의 AFM 심상입니다. 또한 세포 지구 내의 특정 지역의 급상승을 볼 수 있습니다.

숫자 4. (a) 광학적인 단계 대조, (b) 조정 인간적인 폐 섬유아세포의 형광, (c) AFM 및 (d) 결합된 AFM/fluorescence, 60µm 검사.

숫자 5는 녹색 형광성 단백질 및 대응 군대 곡선을 보여주어 박테리아 (슈도모나스 - aeruginosa)의 (GFP) 광학적인 심상입니다. 심상은 객관 10X로 취하고 Nikon FITCHYQ 입방체 형광성 필터를 사용했습니다. 섬유 근원에서 공정한 판단은 또한 (심상의 왼쪽에 눈에 보이는) 외팔보를 이용되었습니다 조명하기 위하여. 중간 현탁액에서 증가된 박테리아는 첫번째이었습니다. 현탁액은 박테리아의 순서를 따라 약간 시간 동안 유리 슬라이드에 그 때 유리에 biofilm 지지자를 성장하기 위하여 내뿜어졌습니다. 유리 슬라이드는 세포 배양 매체로 그 때 동일 매체에서 imaged 헹궈지고. 이 측정에서 사용된 외팔보는 (brightfield 심상에 있는 어두운 그림자로 눈에 보이는) Olympus 60¦Ìm 긴 생물 레버입니다.

응용

광학적인 현미경 (NSOM), confocal, 총 내부 반사율 형광 및 형광 껴울림 에너지 이동 방법을 검사하는 필드의 가까이에 AFM와 (TIRF) epifluorescence ¨C의 많은 적용 예가 (FRET) 있습니다. 연구원은 형광 색소를 가진 견본의 구조 변경의 리스크에 염려할 수 있어, 따라서 경미하게 AFM를 또한 타협하. 그러나, 이 문제를 극소화하는 기술이 거기에 의하여 레테르를 붙이고 있습니다. 1개의 기술은 단백질에 있는 변경하다 형광성 아미노산을 삽입하기 위한 것입니다 (methylglyoxal 교원질에서 삽입과 같은). 많은 실험은 특히 기계적으로 심상에 아닙니다 견본을 및 시작하기 위하여 AFM가 그것 이용될 때, 이 문제점을 전혀 제출하지 않습니다.

Epifluorescence와 AFM

  • 세포막에 레테르를 붙이는 단백질 또는 그밖 분대. Epifluorescence는 막을 광학적으로 정하기 위하여 이용되고 AFM는 고분자 해결책 심상을 장악하기 위하여 이용됩니다 (숫자 4) 또는 견본의 측정 기계적 성질에서 보이는 것처럼 (숫자 5)를 보십시오.
  • 상관 FM와 AFM 심상에 의해 세포막의 유동성을 공부하는 레테르를 붙이는 특정 지질 (DPPC 같이).
  • 소포에 있는 지질의 구성 그리고 배급 동일 소포의 기계 적이고 및 점성과 탄성을 지니는 속성에 관하여 데이터를 장악하는 epifluorescence와 동시 AFM 이용하기를 통해 공부.
  • 발색단의 구조물, 카로티노이드와 염록소 같이, 그들의 광학적인 행동에 관하여 공부.
  • 기계적으로 세포를 흥분하십시오 또는 광학적으로 Ca2+ 같이 생화확적인 반응의 시작한 연결 메시지를, 따르는 AFM 및 FM 이용하기를 가진 세포막의 표면에 몇몇 수용체는 세포 안쪽에 흐릅니다.

숫자 5. (상단)는 광학적인 심상 박테리아를 정하고 외팔보를 두기 위하여 이용되었습니다. 군대 측정은 박테리아에 그 때 세포 (밑바닥 심상)의 경도를 평가하기 위하여 했습니다. 견본은 슈도모나스 - GFP를 보여주는 aeruginosa입니다. 군대 곡선에서는, 파란 곡선은 외팔보의 편향도에 표면에서 철회될 때 대응합니다, 표면에 접근하는 때 빨간 곡선은 편향도에 대응하고. 박테리아에 취한 유리제 기질에 그것에 군대 곡선을 비교하십시오. 가장 현저한 특징은 (파란 수축력 곡선에 부정적인 편향도로 눈에 보이는) 큰 접착입니다. 테리 Beveridge 의 Guelph, 캐나다의 대학의 의례를 간색하십시오.

번민과 AFM

번민은 단백질, 핵산 및 막에 있는 근접 관계 측정을 위해 이용됩니다. 번민 방법을 사용하여, 2개의 실재물 사이 DNA 같이 구조에 있는 변경의 동, 분자 상호 작용을 공부하는 것이 가능합니다. AFM는 이 사건을 구상하기 위하여 동시에 이용될 수 있습니다.

NSOM와 AFM

세포의 동시 AFM와 NSOM 화상 진찰은 막의 탄력 있는 속성의 지형도 작성 화상 진찰 그리고 결심을 허용합니다.

TIRF와 AFM

이 기술은 세포의 상단에 외팔보를 통해 적용된 지방화한 군대에 세포의 반응을 공부하기 위하여 이용될 수 있습니다. 일반적으로, 그것은 형광으로 세포 반응을 따르기 위하여 이용된 AFM 탐사기를 가진 나노미터 수준에 세포를 조작하기 위하여 이용됩니다.

결론

보호 시설 연구에서 MFP-3D-BIO는 동시 AFM와 형광 측정을 위한 선택의 계기입니다. 그것의 유일한 디자인은 이 측정이 쉽고 그리고 정확하게 하는 것을 허용합니다. 단순히 일반적인 AFM 견본 준비를 바꿔서, 연구원은 이 측정을 실행하고 bioscience 응용의 무진장 수에 그들의 실험을 확장할 수 있습니다.

근원: 보호 시설 연구

이 근원에 추가 정보를 위해 보호 시설 연구를 방문하십시오

Date Added: Jul 26, 2006 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 09:35

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