De Gelijktijdige AtoomMicroscopie die van de Kracht en van de Fluorescentie mfp-3D AFM Van het Onderzoek van het Asiel Gebruiken

Besproken Onderwerpen

Achtergrond
Het Combineren van de AtoomMicroscopie van de Kracht en de Microscopie van de Fluorescentie
De Vereisten van de Instrumentatie
Beschrijving en Opstelling
De Voorbereiding van de Steekproef
De Voorbeelden van het Beeld
Toepassingen
Epifluorescence en AFM
LIJSTWERK en AFM
NSOM en AFM
TIRF en AFM
Conclusie

Achtergrond

Combineren van de AtoomMicroscopie van de Kracht (AFM) en de fluorescentiemicroscopie (FM) is lang van belang voor biologen geweest. Deze twee types van microscopen verstrekken individueel unieke informatie over steekproeven.

Het Combineren van de AtoomMicroscopie van de Kracht en de Microscopie van de Fluorescentie

De microscopie van de Fluorescentie wordt typisch gebruikt om specifieke molecules te ontdekken. Nochtans, heeft deze microscopietechniek vaak een aantal nadelen met inbegrip van beperkte ruimteresolutie en complexe steekproefvoorbereiding. Een Andere beperking van deze microscopie is dat de molecule aan fluorochrome moet worden gebonden, die beurtelings, kan de staat van de molecule veranderen.

anderzijds die, is AFM een meting met een cantilever wordt gemaakt die afgetast kruis de oppervlakte is.

Figuur 1. Mfp-3D - BIO staat gelijktijdige optisch en metingen AFM op een omgekeerde optische ideale microsope, voor biologische wetenschaptoepassingen toe.

Het verstrekt driedimensionele moleculaire resolutie van biologische molecules zonder extra tegenover elkaar stellende agent (zoals fluorochrome, kleurstoffen, enz.) of compromis aan de steekproef. Bovendien is AFM ook een hogere resolutiemeting die niet vluchtig is.

Het Gebruiken van deze microscopietechnieken voorziet gelijktijdig de gebruiker van hoge resolutieweergave op specifieke molecules en opent ook de deur voor een grote verscheidenheid van onderzoekexperimenten. In dit artikel, zullen wij de instrumentatie en de opstelling, steekproefvoorbereiding, toepassingen, beschrijven en zullen experimentele voorbeelden van de techniek geven.

De Vereisten van de Instrumentatie

De Succesvolle gelijktijdige metingen van AFM en van FM vereisen specifieke configuraties van beide instrumenten. Vooral, moet AFM zich niet in de meting van FM mengen. Omdat de meeste commerciële AFMs dioden van de gebruiks rode laser om de afbuiging van de cantilever te verlichten en te ontdekken, de fluorescente golflengten niet kunnen worden waargenomen. Nochtans, het mfp-3D gebruik van het Onderzoek van het Asiel een infrarode superluminescent diode met verminderde emissie bij de meeste fluorescente golflengten. Dit staat het bekijken van zowel de fluorescentie als beeld AFM toe (zie Figuur 2).

Figuur 2. Fluorochrome Opwinding (blauwe) (rode) /Emission en mfp-3D lichte golflengte SLD.

Bovendien hebben beide metingen potentieel tegenstrijdige ruimtebeperkingen. De microscoop van FM vereist dat de steekproef aan de omgekeerde microscoopdoelstellingen dicht is. Voor AFM, moet de cantilever ook dicht bij de steekproef voor weergave verblijven. Mfp-3D wordt specifiek ontworpen zodat de steekproef zowel door de omgekeerde optische microscoop als het aftastenstadium van AFM kan worden betreden.

De mfp-3D scanner rust op de bovenkant van een omgekeerde microscoop en verleent bijna onbeperkte optische toegang tot de steekproef van onderaan, makend het gemakkelijk om met fluorescentiemicroscopen, met inbegrip van confocal epifluorescence, TIRF en LIJSTWERK te combineren.

Beschrijving en Opstelling

Mfp-3d-BIOAFM is het ideale instrument om de gelijktijdige metingen uit te voeren. Dit model heeft een grondplaat en een X-Y scanner die bovenop een omgekeerde optische die microscoop rusten (door Olympus, Zeiss of Nikon wordt vervaardigd). Deze stadium en scannerregeling staan zowel eenvoudige groepering van het uiteinde AFM met het optische as als submicron plaatsen van de steekproef in twee afmetingen toe. Het is ook compatibel met om het even welke omgekeerde optische doelstellingen met inbegrip van hoge numerieke opening 100X en doelstellingen TIRF. Figuur 1 toont een opstelling van mfp-3d-BIO opgezet die op een Nikon te2000-e voor fluorescentie wordt uitgerust.

Tijdens verrichting, zendt mfp-3D AFM infrarode SLD tussen 840 en 880nm uit. Omdat de meesten fluorophores opwinding en emissiegolflengten onder deze waarden hebben, is er geen interferentie (zie Figuur 2).

De Voorbereiding van de Steekproef

De steekproefvoorbereiding voor gelijktijdige metingen is gelijkaardig aan dat gebruikt voor weergave AFM. Nochtans, in de fluorescentiemicroscopie, kunnen de lichte signalen vaag zijn. Sommige gemeenschappelijke methodes om de efficiency van fluorescente emissies te verhogen kunnen niet in mfp-3D worden gebruikt omdat het de sonde AFM zou verhinderen het komen van in contact met de steekproef ¨C bijvoorbeeld, het gebruiken van een hydrophobic middel en het vervangen van water met glycerol, of anti-oxyderend toe te voegen, om de efficiency van de fluorescentie te verhogen.

Deze methodes vereisen typisch dat coverslip bovenop de steekproef wordt geplaatst om het te beschermen en te bewaren. Aangezien zulk een coverslip de sonde AFM verhindert met de steekproef in wisselwerking te staan, moet deze stap in steekproefvoorbereiding worden weggelaten. In Plaats Daarvan, moet de voorbereiding aan elke steekproef worden aangepast en de hoeveelheid fluorescente kleurstof moet aan de nieuwe weergavevoorwaarden worden aangepast. Bijvoorbeeld, zou het noodzakelijk kunnen zijn om de hoeveelheid fluorochrome te verhogen die aan het specimen gaat binden om een groter signaal voor de meting van FM te verkrijgen. Neem van, echter nota, dat aangezien dit in een verlies van bindende specificiteit van de kleurstof kan resulteren, en een compromis kan moeten worden gevonden.

De Voorbeelden van het Beeld

Figuur 3 toont localisatie van actin gloeidraden met betrekking tot de oppervlaktetopografie van enige cellen gebruikend een gecombineerde TIRFM/AFM. HeLa cellen werden gekweekt op formaline-vast die coverslips van de glasmicroscoop, permeabilized met Triton x-100, met TRITC -TRITC-phalloidin wordt geëtiketteerd, met aceton wordt gewassen en droog. De Weergave werd uitgevoerd gebruikend een op bestelling gemaakte combinatie van mfp-3D die AFM en een microscoop TIRF op een IX81 microscoop Olympus wordt geconstrueerd. De Topografische en fluorescentiegegevens werden gelijktijdig verzameld. De Topografische gegevens werden verworven op niet-contactwijze gebruikend een cantilever van de Zonde (Olympus AC160). Het beeld toont het Tirf- gegevenskanaal op de teruggegeven topografie die AFM wordt bedekt.

Figuur 3. Bedekte tirf- gegevens over teruggegeven topografie AFM van HeLa Cellen. De hoffelijkheid Miklós S.Z. de Groep van Kellermayer van het Beeld, van de Nanobiotechnologie en van de Biofysica van de enig-Molecule, Universiteit van Pécs, Hongarije.

Figuur 4 toont een voorbeeld van een epitheliaale cel. Deze beelden werden genomen met een fluordoelstelling van Nikon S van de olieonderdompeling 100X. Het grijze beeld is een brightfieldbeeld met wat extra wit licht die het steekproefgebied verlichten. Dit laat de cantilever (Olympus AC 240) toe om eveneens worden gevisualiseerd. Het tweede beeld in de opeenvolging is het fluorescentiebeeld. Het derde beeld is het beeld AFM van de zelfde die cel op AC wijze wordt genomen. U kunt het gezoem van het specifieke gebied binnen het celgebied ook zien.

Figuur 4. (a) optisch fasecontrast, (b) fluorescentie, (c) AFM, en (d) gecombineerde AFM/fluorescence van vaste menselijke longfibroblasten, 60µm aftasten.

Figuur 5 is een optisch beeld van bacteriën die (Pseudomonas - aeruginosa) een Groene Fluorescente Eiwit en (GFP) overeenkomstige krachtkrommen tonen. Het beeld werd genomen met een 10X doelstelling en gebruikte een de kubus fluorescente filter van Nikon FITCHYQ. Het Witte licht uit een vezelbron werd ook gebruikt om de zichtbare cantilever (op de linkerkant van het beeld) te verlichten. De bacteriën werden eerst gekweekt in een middelgrote opschorting. De opschorting werd toen gespoeld over een glasplaatje voor een paar uren opdat de bacteriën een biofilmaanhanger aan glas kweken. Het glasplaatje werd toen gespoeld met het middel van de celcultuur en imaged in het zelfde middel. De cantilever in deze meting wordt gebruikt is een 60¦Ìm lange zichtbare bio-Hefboom Olympus (als donkere schaduw in het brightfieldbeeld dat).

Toepassingen

Er zijn vele toepassingsvoorbeelden van AFM en epifluorescence ¨C Dichtbij Gebied die Optische Microscoop (NSOM) Aftasten, confocal, Totale Interne methodes van de Overdracht (TIRF) van de Fluorescentie van de Reflectiecoëfficiënt, en van de Resonantie-energie van de Fluorescentie (FRET). De Onderzoekers kunnen bij het risico betrokken zijn om de bouw van het specimen met fluorochrome te wijzigen, waarbij lichtjes AFM eveneens wordt gecompromitteerd. Nochtans, zijn er etiketteringstechnieken die dit probleem minimaliseren. Één techniek moet een gewijzigd en fluorescent aminozuur in een proteïne (zoals methylglyoxal opnemen in collageen) opnemen. Vele experimenten stellen deze kwestie helemaal niet voor, in het bijzonder wanneer AFM wordt gebruikt om een specimen en niet aan beeld mechanisch teweeg te brengen het.

Epifluorescence en AFM

  • Etiketterende proteïnen of andere componenten op een celmembraan. Epifluorescence wordt gebruikt om van het membraan optisch de plaats te bepalen en AFM wordt gebruikt om een hoogte te verkrijgen - moleculair resolutiebeeld (zoals aangetoond in Figuur 4) of maatregelen mechanische eigenschappen van de steekproeven (zie Figuur 5).
  • Etiketterend bepaalde lipiden (als DPPC) om de vloeibaarheid van celmembraan te bestuderen door FM en beelden te correleren AFM.
  • Het Bestuderen van de samenstelling en de distributie van lipiden in blaasjes door epifluorescence en het gebruiken van gelijktijdige AFM om gegevens over de mechanische en viscoelastic eigenschappen van de zelfde blaasjes te verkrijgen.
  • Bestuderend de structuur van chromophores, zoals carotenoïden en chlorofyl, met betrekking tot hun optisch gedrag.
  • Wek Mechanisch een cel of zelfs sommige receptoren aan de oppervlakte van een celmembraan met op AFM en het gebruiken van FM een teweeggebrachte cascade van biochemische reacties, zoals Ca2+ stroom binnen de cel optisch om te volgen.

Figuur 5. (Bovenkant) het optische beeld werd gebruikt om van de bacteriën de plaats te bepalen en de cantilever te plaatsen. Metingen van de Kracht werden toen gemaakt op de bacteriën om de hardheid van de cel (bodembeeld) te beoordelen. De steekproef is Pseudomonas - aeruginosa tonend GFP. In de krachtkrommen, beantwoordt de blauwe kromme aan de afbuiging van de cantilever wanneer het van de oppervlakte wordt teruggetrokken, en de rode kromme beantwoordt aan de afbuiging aangezien het de oppervlakte nadert. Vergelijk de krachtkromme op de bacteriën wordt genomen bij dat op een glassubstraat dat. De opvallendste eigenschap is de grote zichtbare adhesie (als negatieve afbuiging op de blauwe intrekkenkromme). De hoffelijkheid van de Steekproef van Terry Beveridge, Universiteit van Guelph, Canada.

LIJSTWERK en AFM

Het LIJSTWERK wordt gebruikt voor het meten van nabijheidsrelaties in proteïnen, nucleic zuren, en membranen. Gebruikend een methode van het LIJSTWERK, is het mogelijk om de dynamische van veranderingen in bouw zoals DNA, of moleculaire interactie tussen twee entiteiten te bestuderen. AFM kan worden gebruikt gelijktijdig om deze gebeurtenissen te visualiseren.

NSOM en AFM

De Gelijktijdige weergave AFM en NSOM van cellen laat topografische weergave en de bepaling van de elastische eigenschappen van het membraan toe.

TIRF en AFM

Deze techniek kan worden gebruikt om de reactie te bestuderen van cellen op gelokaliseerde die krachten via de cantilever op de bovenkant van de cellen worden toegepast. Meer over het algemeen, wordt het gebruikt die cellen op het nanometerniveau met de sonde te manipuleren AFM wordt gebruikt om de celreactie met fluorescentie te volgen.

Conclusie

Mfp-3d-BIO van het Onderzoek van het Asiel is het instrument van keus voor de gelijktijdige metingen van AFM en van de fluorescentie. Zijn uniek ontwerp laat deze metingen toe om gemakkelijk en precies worden gemaakt. Door de normale AFM steekproefvoorbereiding eenvoudig te veranderen, kunnen de onderzoekers deze metingen uitvoeren en hun experimenten verbreden aan een onbegrensd aantal biologische wetenschaptoepassingen.

Bron: Het Onderzoek van het Asiel

Voor meer informatie over deze bron te bezoeken gelieve het Onderzoek van het Asiel

Date Added: Jul 26, 2006 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 09:19

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit