Força e Microscopia de Fluorescência Atômicas Simultâneas Usando o MFP-3D AFM Da Pesquisa do Asilo

Assuntos Cobertos

Fundo
Combinando a Microscopia Atômica da Força e a Microscopia de Fluorescência
Exigências da Instrumentação
Descrição e Instalação
Preparação da Amostra
Exemplos da Imagem
Aplicações
Epifluorescence e AFM
FRICÇÃO e AFM
NSOM e AFM
TIRF e AFM
Conclusão

Fundo

Combinar a Microscopia Atômica da Força (AFM) e a microscopia de fluorescência (FM) tem sido por muito tempo do interesse para biólogos. Estes dois tipos de microscópios fornecem individualmente a informação original sobre amostras.

Combinando a Microscopia Atômica da Força e a Microscopia de Fluorescência

A microscopia de Fluorescência é usada tipicamente para detectar moléculas específicas. Contudo, esta técnica da microscopia tem freqüentemente um número de inconvenientes incluir definição espacial limitada e a preparação complexa da amostra. Uma Outra limitação desta microscopia é que a molécula deve ser limitada ao fluorochrome, que por sua vez, pode alterar o estado da molécula.

por outro lado, o AFM é uma medida feita com um modilhão que seja cruz feita a varredura a superfície.

Figura 1. Os MFP-3D - BIO permite medidas simultâneas ópticas e do AFM em um microsope óptico invertido, ideal para aplicações da ciência biológica.

Fornece a definição molecular tridimensional de moléculas biológicas sem o agente de contraste adicional (tal como o fluorochrome, as tinturas, Etc.) ou de acordo à amostra. Além, o AFM é igualmente uma medida mais de alta resolução que seja não-breve.

Usar estas técnicas da microscopia fornece simultaneamente o usuário a imagem lactente de alta resolução em moléculas específicas e igualmente abre a porta a uma grande variedade de experiências da pesquisa. Neste artigo, nós descreveremos a instrumentação e a instalação, preparação da amostra, aplicações, e damos exemplos experimentais da técnica.

Exigências da Instrumentação

As medidas simultâneas Bem Sucedidas do AFM e do FM exigem configurações específicas de ambos os instrumentos. Principalmente, o AFM não deve interferir com a medida de FM. Porque a maioria de diodos láser vermelhos do uso comercial de AFMs para iluminar e detectar a deflexão do modilhão, os comprimentos de onda fluorescentes não podem ser observados. Contudo, a Pesquisa MFP-3D do Asilo usa um diodo superluminescent infravermelho com comprimentos de onda fluorescentes reduzidos da emissão no máximo. Isto permite a ideia da fluorescência e da imagem do AFM (veja Figura 2).

Figura 2. Excitação do Fluorochrome /Emission (azul) (vermelho) e de luz de MFP-3D SLD comprimento de onda.

Além, ambas as medidas têm limitações espaciais potencial de oposição. O microscópio de FM exige que a amostra seja próxima aos objetivos do microscópio invertido. Para o AFM, o modilhão deve igualmente residir perto da amostra para a imagem lactente. O MFP-3D é projectado especificamente de modo que a amostra possa ser alcançada pelo microscópio óptico invertido e pela fase da exploração do AFM.

O varredor de MFP-3D descansa na parte superior de um microscópio invertido e fornece acesso óptico quase ilimitado à amostra de baixo de, fazendo a fácil combinar com os microscópios de fluorescência, incluindo o epifluorescence, confocal, o TIRF e a FRICÇÃO.

Descrição e Instalação

O MFP-3D-BIO AFM é o instrumento ideal para executar as medidas simultâneas. Este modelo tem uma placa baixa e um varredor X-Y que descansem sobre um microscópio óptico invertido (manufacturado por Olympus, por Zeiss ou por Nikon). Este regime da fase e do varredor permite o alinhamento simples da ponta do AFM com a linha central óptica e o posicionamento submicrónico da amostra em duas dimensões. É igualmente compatível com todos os objetivos ópticos invertidos que incluem a abertura numérica alta 100X e os objetivos de TIRF. Figura 1 mostra uma instalação do MFP-3D-BIO montado em um Nikon TE2000-E equipada para a fluorescência.

Durante a operação, o MFP-3D AFM SLD infravermelho emite-se entre 840 e 880nm. Porque a maioria de fluorophores têm comprimentos de onda da excitação e da emissão abaixo destes valores, não há nenhuma interferência (veja Figura 2).

Prove a Preparação

A preparação da amostra para medidas simultâneas é similar àquela usada para a imagem lactente do AFM. Contudo, na microscopia de fluorescência, os sinais claros podem ser fracos. Alguns métodos comuns de aumentar a eficiência de emissões fluorescentes não podem ser usados no MFP-3D porque impediria que a ponta de prova do AFM entre o contacto com o ¨C da amostra por exemplo, usando um media hidrofóbica e substituindo a água com o glicerol, ou adicionando antioxidantes, para aumentar a eficiência da fluorescência.

Estes métodos exigem tipicamente que uma lamela esteja colocada sobre a amostra para a proteger e preservar. Desde Que tal lamela impede que a ponta de prova do AFM interaja com a amostra, esta etapa na preparação da amostra deve ser omitida. Em Lugar De, a preparação deve ser costurada a cada amostra e a quantidade de tintura fluorescente tem que ser adaptada às condições novas da imagem lactente. Por exemplo, pôde ser necessário aumentar a quantidade de fluorochrome que está indo ligar ao espécime para obter um sinal maior para a medida de FM. A Nota, contudo, que desde que esta pode conduzir a uma perda de especificidade obrigatória da tintura, e a um acordo pode precisar de ser encontrado.

Exemplos da Imagem

Figura 3 mostra a localização de filamentos do actínio relativo à topografia de superfície de únicas pilhas usando um TIRFM/AFM combinado. As pilhas HeLa foram crescidas nas lamelas de vidro do microscópio, formaline-fixo, permeabilized com Triton X-100, etiquetadas com TRITC-phalloidin, lavadas com acetona e secadas. A Imagem Lactente foi realizada usando uma combinação feito por encomenda do MFP-3D AFM e um microscópio de TIRF construído em um microscópio de Olympus IX81. Os dados Topográficos e da fluorescência foram recolhidos simultaneamente. Os dados Topográficos foram adquiridos no modo do não-contacto usando um modilhão do Pecado (Olympus AC160). A imagem mostra o canal de dados de TIRF coberto na topografia rendida do AFM.

Figura 3. dados de TIRF cobertos na topografia rendida do AFM de Pilhas HeLa. Grupo da cortesia de Imagem Miklós S.Z. Kellermayer, da Nanobiotecnologia e da Biofísica da Único-Molécula, Universidade de Pécs, Hungria.

Figura 4 mostra um exemplo de uma pilha epitelial. Estas imagens foram tomadas com um objetivo do fluor da imersão 100X Nikon S do petróleo. A imagem cinzenta é uma imagem do brightfield com alguma luz branca adicional que ilumina a região da amostra. Isto permite que o modilhão (C.A. 240 de Olympus) seja visualizado também. A segunda imagem na seqüência é a imagem da fluorescência. A terceira imagem é a imagem do AFM do mesmo modo recolhido pilha da C.A. Você pode igualmente ver o zoom da área específica dentro da região da pilha.

Figura 4. (a) contraste óptico da fase, (b) fluorescência, (c) AFM, e (d) AFM/fluorescence combinado de fibroblasto humanos fixos do pulmão, varredura de 60µm.

Figura 5 é uma imagem óptica das bactérias (Pseudomonas - aeruginosa) que mostram uma Proteína Fluorescente Verde (GFP) e umas curvas correspondentes da força. A imagem foi tomada com um 10X objetivo e usou um filtro fluorescente do cubo de Nikon FITCHYQ. A luz Branca de uma fonte da fibra foi usada igualmente para iluminar o modilhão (visível no lado esquerdo da imagem). As bactérias eram primeiras crescidas em uma suspensão média. A suspensão foi nivelada então sobre uma placa de vidro por algumas horas para que as bactérias cresçam um aderente do biofilm ao vidro. A placa de vidro foi enxaguada então com o media de cultura celular e imaged no mesmo media. O modilhão usado nesta medida é uma Bio-Alavanca 60¦Ìm longa de Olympus (visível como uma sombra escura na imagem do brightfield).

Aplicações

Há muitos exemplos de aplicação do AFM e do ¨C do epifluorescence Perto do Campo que Faz A Varredura de métodos Internos Ópticos do Microscópio (NSOM), os confocal, os Totais da Reflectância (TIRF) da Fluorescência, e da Ressonância da Fluorescência de Energia (FRET) de Transferência. Os Pesquisadores podem ser estados relacionados com o risco de alterar a conformação do espécime com o fluorochrome, assim ligeira comprometendo o AFM também. Contudo, está etiquetando as técnicas que minimizam este problema. Uma técnica é introduzir um ácido aminado alterado e fluorescente em uma proteína (tal como a introdução methylglyoxal no colagénio). Muitas experiências não apresentam esta edição de todo, particularmente quando o AFM é usado para provocar mecanicamente um espécime e não à imagem ele.

Epifluorescence e AFM

  • Proteínas de Rotulagem ou outros componentes em uma membrana de pilha. Epifluorescence é usado para posicionar óptica a membrana e o AFM é usado para obter uma elevação - imagem molecular da definição (segundo as indicações de Figura 4) ou propriedades mecânicas da medida das amostras (veja Figura 5).
  • Determinados lipidos de Rotulagem (como DPPC) para estudar a fluidez da membrana de pilha por imagens de correlacionamento de FM e do AFM.
  • Estudando a composição e a distribuição dos lipidos nas vesículas com o epifluorescence e da utilização do AFM simultâneo obter dados sobre as propriedades mecânicas e viscoelastic das mesmas vesículas.
  • Estudando a estrutura dos cromóforo, como carotenóides e clorofila, com relação a seu comportamento óptico.
  • Excite Mecanicamente uma pilha ou mesmo alguns receptors na superfície de uma membrana de pilha com o AFM e a utilização de FM seguir óptica uma cascata provocada de reacções bioquímicas, como Ca2+ fluem dentro da pilha.

Figura 5. (Parte Superior) A imagem óptica foi usada para posicionar as bactérias e para posicionar o modilhão. As medidas da Força foram feitas então nas bactérias para avaliar a dureza da pilha (imagem inferior). A amostra é Pseudomonas - aeruginosa que mostra GFP. Nas curvas da força, a curva azul corresponde à deflexão do modilhão quando está sendo retirada da superfície, e a curva vermelha corresponde à deflexão enquanto está aproximando a superfície. Compare a curva da força tomada nas bactérias àquela em uma carcaça de vidro. A característica a mais impressionante é a grande adesão (visível como uma deflexão negativa na curva azul da retração). Prove a cortesia de Terry Beveridge, Universidade de Guelph, Canadá.

FRICÇÃO e AFM

A FRICÇÃO é usada medindo relações da proximidade nas proteínas, em ácidos nucleicos, e em membranas. Usando um método da FRICÇÃO, é possível estudar a interacção dinâmica das mudanças na conformação como o ADN, ou molecular entre duas entidades. O AFM pode ser usado simultaneamente para visualizar estes eventos.

NSOM e AFM

A imagem lactente Simultânea do AFM e do NSOM das pilhas permite a imagem lactente topográfica e a determinação das propriedades elásticas da membrana.

TIRF e AFM

Esta técnica pode ser usada para estudar a resposta das pilhas às forças localizadas aplicadas através do modilhão na parte superior das pilhas. Mais geralmente, é usada para manipular pilhas no nível do nanômetro com a ponta de prova do AFM usada para seguir a reacção da pilha com a fluorescência.

Conclusão

O MFP-3D-BIO da Pesquisa do Asilo é o instrumento da escolha para medidas simultâneas do AFM e da fluorescência. Seu projecto original permite que estas medidas sejam feitas facilmente e precisamente. Simplesmente alterando a preparação normal da amostra do AFM, os pesquisadores podem executar estas medidas e alargar suas experiências a um número ilimitado de aplicações da ciência biológica.

Source: Pesquisa do Asilo

Para obter mais informações sobre desta fonte visite por favor a Pesquisa do Asilo

Date Added: Jul 26, 2006 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 09:47

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit