Одновременные Атомные Усилие и Микроскопия Флуоресцирования Используя MFP-3D AFM От Исследования Убежища

Покрытые Темы

Предпосылка
Совмещать Атомную Микроскопию Усилия и Микроскопию Флуоресцирования
Требования К Измерительного Оборудования
Описание и Настроение
Подготовка Образца
Примеры Изображения
Применения
Epifluorescence и AFM
ЛАД и AFM
NSOM и AFM
TIRF и AFM
Заключение

Предпосылка

Совмещать Атомную Микроскопию Усилия (AFM) и микроскопию флуоресцирования (FM) длиной представил интерес для биологов. Эти 2 типа микроскопов индивидуально обеспечивают уникально информацию о образцах.

Совмещать Атомную Микроскопию Усилия и Микроскопию Флуоресцирования

Микроскопия Флуоресцирования типично использована для того чтобы обнаружить специфические молекулы. Однако, этот метод микроскопии часто имеет несколько недостатков включая лимитированное пространственное разрешение и сложную подготовку образца. Другое ограничение этой микроскопии что молекула необходимо прыгнуть к флуорохрому, который в свою очередь, может изменить положение молекулы.

с другой стороны, AFM измерение сделанное с cantilever который просмотренный крест поверхность.

Диаграмма 1. MFP-3D - БИО позволяет одновременным измерениям оптически и AFM на перевернутом оптически microsope, идеально для применений биологических наук.

Она снабубегут трехмерное молекулярное разрешение биологических молекул без дополнительного сравнивая агента (как флуорохром, краски, Etc.) или компромисса образец. В добавлении, AFM также более высокое измерение разрешения которое non-мимолетно.

Используя эту микроскопию методы одновременно обеспечивают пользователя с высоким воображением разрешения на специфических молекулах и также раскрывают дверь к большому разнообразию экспериментов по исследования. В настоящей статье, мы опишем измерительное оборудование и настроение, подготовку образца, применения, и даем экспириментально примеры метода.

Требования К Измерительного Оборудования

Успешные одновременные измерения AFM и FM требуют специфических конфигураций обеих аппаратур. На первом плане, AFM не должно помешать с измерением FM. Потому Что большинств лазерными диодами коммерчески пользы AFMs красными для того чтобы осветить и обнаружить отклонение cantilever, дневные длины волны нельзя наблюдать. Однако, Исследование MFP-3D Убежища использует ультракрасный superluminescent диод с уменьшенными длинами волны излучения по большей мере дневными. Это позволяет осматривать как флуоресцирования, так и изображения AFM (см. Диаграмму 2).

Диаграмма 2. Возбуждение Флуорохрома (голубое) /Emission (красное) и свет MFP-3D SLD длина волны.

В добавлении, оба измерения имеют потенциально противоречя пространственные ограничения. Микроскоп FM требует что образец близко к задачам перевернутого микроскопа. Для AFM, cantilever должен также пребывать близко к образцу для воображения. MFP-3D конструировано специфически так, что образец сможет быть достиган как перевернутым оптически микроскопом, так и этапом скеннирования AFM.

Блок развертки MFP-3D отдыхает на верхней части перевернутого микроскопа и обеспечивает почти неограниченный оптически доступ к образцу снизу, делающ его легким совместить с люминесцентными микроскопами, включая epifluorescence, confocal, TIRF и ЛАД.

Описание и Настроение

MFP-3D-BIO AFM идеально аппаратура для того чтобы выполнить одновременные измерения. Эта модель имеет базовую платину и X-Y блок развертки которая отдыхают na górze перевернутого оптически микроскопа (изготовленного Olympus, Zeiss или Nikon). Это расположение этапа и блока развертки позволяет и простому выравниванию подсказки AFM с оптически располагать оси и субмикрона образца в 2 размерах. Оно также совместим с всеми перевернутыми оптически задачами включая высокую численную апертуру 100X и задачи TIRF. На Диаграмму 1 показано настроение MFP-3D-BIO установленного на Nikon TE2000-E оборудованное для флуоресцирования.

Во Время деятельности, MFP-3D AFM ультракрасное SLD испускает между 840 и 880nm. Потому Что большинств fluorophores имеют длины волны возбуждения и излучения под этими значениями, никакое взаимодействие (см. Диаграмму 2).

Попробуйте Подготовку

Подготовка образца для одновременных измерений подобна к подготовкиспользуемой для воображения AFM. Однако, в микроскопии флуоресцирования, светлые сигналы могут быть слабый. Некоторые общие методы увеличивать эффективность дневных излучений нельзя использовать в MFP-3D потому что оно предотвратило бы зонд AFM от приходить в контакт с ¨C образца например, используя гидродобное средство и заменять воду с глицеролом, или добавлять противостарители, для того чтобы увеличить эффективность флуоресцирования.

Эти методы типично требуют, чтобы coverslip был помещен na górze образца для того чтобы защитить и сохранить его. В Виду Того Что такой coverslip предотвращает зонд AFM от взаимодействовать с образцом, этот шаг в подготовку образца необходимо снять. Вместо, подготовку необходимо портняжничать к каждому образцу и количество люминесцентной краски должно быть приспособлено к новым условиям воображения. Например, могло быть необходимо увеличить количество флуорохрома который идет связать к образцу для того чтобы получить более большой сигнал для измерения FM. Примечание, однако, что в виду того что это может привести к в потере binding характерности краски, и компромиссе может быть найденным.

Примеры Изображения

На Диаграмму 3 показано локализацию нитей актина по отношению к поверхностной топографии одиночных клеток используя совмещенное TIRFM/AFM. HeLa клетки рослись на стеклянных coverslips микроскопа, формалин-фикчировано, были permeabilized с Тритоном X-100, были обозначены с TRITC-phalloidin, были помыты с ацетоном и были высушены. Воображение было унесено используя таможню - построенное сочетание из MFP-3D AFM и микроскоп TIRF построило на микроскопе Olympus IX81. Данные по Топографических и флуоресцирования были собраны одновременно. Топографические данные были приобретены в внеконтактном режиме используя cantilever Согрешения (Olympus AC160). Изображение показывает канал данным по TIRF overlaid на представленной топографии AFM.

Диаграмма 3. overlaid данные по TIRF на представленной топографии AFM HeLa Клеток. Группа учтивости Изображения Miklós S.Z. Kellermayer, Nanobiotechnology и Биофизики Одиночн-Молекулы, Университет Pécs, Венгрии.

На Диаграмму 4 показано пример покровной клетки. Эти изображения были приняты с задачей fluor погружения 100X Nikon S масла. Серое изображение изображение brightfield при некоторый дополнительный белый свет освещая зону образца. Это позволяет cantilever (AC 240 Olympus) быть визуализированным также. Второе изображение в последовательности изображение флуоресцирования. Третье изображение изображение AFM такой же клетки принятой в режим AC. Вы можете также увидеть сигнал специфической зоны в пределах зоны клетки.

Диаграмма 4. (A) оптически контраст участка, флуоресцирование (B), (C) AFM, и (D) совмещенное AFM/fluorescence фикчированных людских фиброцитов легкего, развертка 60µm.

Диаграмма 5 оптически изображение бактерий (Псевдомонасов - aeruginosa) показывая Зеленый Дневной Протеин (GFP) и соответствуя кривые усилия. Изображение было принято с 10X объективным и использовало фильтр кубика Nikon FITCHYQ дневной. Белый свет от источника волокна также был использован для того чтобы осветить cantilever (видимый на левой стороне изображения). Бактерии были первыми, котор росли в средств подвесе. Подвес после этого был потоплен над стеклянной вставкой на немного часов для того бактерии для того чтобы вырасти ревнитель biofilm к стеклу. Стеклянная вставка после этого была прополоскана с культурной средой клетки и imaged в таком же средстве. Cantilever используемый в этом измерении 60¦Ìm длинняя Био-Рукоятка Olympus (видимая как темная тень в изображении brightfield).

Применения

Много примеров применения AFM и ¨C epifluorescence Около Поля Просматривая Оптически методы Микроскопа (NSOM), confocal, Полных Внутренние Отражения (TIRF) Флуоресцирования, и Резонанса Флуоресцирования (FRET) Перекачки Энергии. Исследователя могут быть обеспокоенный с риском дорабатывать конформацию образца с флуорохромом, таким образом немножко компрометирующ AFM также. Однако, там обозначают методы которые уменьшают эту проблему. Один метод ввести доработанную и дневную аминокислоту в протеин (как вводить methylglyoxal в коллаген). Много экспериментов не представляют этот вопрос на всех, в частности когда AFM использован механически для того чтобы вызвать образец и не к изображению оно.

Epifluorescence и AFM

  • Обозначая протеины или другие компоненты на мембране клетки. Epifluorescence использовано для того чтобы устроить мембрану оптически и AFM использован для того чтобы получить высокомолекулярное изображение разрешения (как показано в Диаграмме 4) или свойствах измерения механически образцов (см. Диаграмму 5).
  • Обозначая некоторые липиды (как DPPC) для того чтобы изучить текучесть мембраны клетки путем сопоставляя изображения FM и AFM.
  • Изучающ состав и распределение липидов в vesicles через epifluorescence и использование одновременного AFM получить данные о механически и вязко-эластических свойствах таких же vesicles.
  • Изучающ структуру хромофоров, как каротиноиды и хлорофилл, по отношению к их оптически поведению.
  • Механически возбудите клетку или даже некоторые приемные устройства на поверхности мембраны клетки с AFM и использованием FM оптически следовать вызванным каскадом биохимических реакций, как Ca2+ пропускают внутри клетки.

Диаграмма 5. (Верхняя Часть) Оптически изображение была использована для того чтобы устроить бактерии и расположить cantilever. Измерения Усилия после этого были сделаны на бактериях для того чтобы определить твердость клетки (нижнего изображения). Образец Псевдомонасы - aeruginosa показывая GFP. В кривых усилия, голубая кривый соответствует к отклонению cantilever когда она разделяется от поверхности, и красная кривый соответствует к отклонению по мере того как она причаливает поверхности. Сравните кривый усилия принятую на бактерии к тому на стеклянном субстрате. Самая поразительная характеристика большое прилипание (видимое как отрицательное отклонение на голубой кривом стягивания). Попробуйте учтивость Терри Beveridge, Университета Guelph, Канады.

ЛАД и AFM

ЛАД использован для измерять отношения близости в протеинах, нуклеиновых кислотах, и мембранах. Используя метод ЛАДА, возможно изучить динамическое изменений в конформации как ДНА, или молекулярное взаимодействие между 2 реальностями. AFM можно использовать одновременно для того чтобы визуализировать эти случаи.

NSOM и AFM

Одновременное воображение AFM и NSOM клеток позволяет топографическое воображение и определение эластичных свойств мембраны.

TIRF и AFM

Этот метод можно использовать для того чтобы изучить реакцию клеток к локализованным усилиям прикладной через cantilever на верхней части клеток. Более вообще, он использован для того чтобы манипулировать клетки на уровне нанометра при зонд AFM используемый для следования реакции клетки с флуоресцированием.

Заключение

MFP-3D-BIO от Исследования Убежища аппаратура выбора для одновременных измерений AFM и флуоресцирования. Своя уникально конструкция позволяет этим измерениям быть сделанным легко и точно. просто изменять нормальную подготовку образца AFM, исследователя могут выполнить эти измерения и расширить их эксперименты к безграничному количеству применений биологических наук.

Источник: Исследование Убежища

Для больше информации на этом источнике пожалуйста посетите Исследование Убежища

Date Added: Jul 26, 2006 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 09:50

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit