Samtidig Atom- Styrka och FluorescenceMicroscopy genom Att Använda MFPEN-3D AFM Från AsylForskning

Täckte Ämnen

Bakgrund
Kombination av Atom- StyrkaMicroscopy och av FluorescenceMicroscopy
InstrumentationKrav
Beskrivningen och Ställer In
Ta Prov Förberedelsen
Avbilda Exempel
Applikationer
Epifluorescence och AFM
GRINIGHET och AFM
NSOM och AFM
TIRF och AFM
Avslutning

Bakgrund

Kombination av Atom- StyrkaMicroscopy (AFM) och av fluorescencemicroscopy (FM) long har long varit av intresserar för biologer. Dessa två typer av mikroskop ger individuellt unik information om tar prov.

Kombination av Atom- StyrkaMicroscopy och av FluorescenceMicroscopy

Fluorescencemicroscopy är typisk van vid avkänner specifika molekylar. Emellertid har denna microscopyteknik vanligt ett nummer av nackdelar begränsade däribland rumslig upplösning, och komplex tar prov förberedelsen. En Annan begränsning av denna microscopy är, att molekylen måste vara destinerad till fluorochromen, som i sin tur, kan förändra det statligt av molekylen.

Å andra sidan är AFM en mätning som göras med en cantilever som är avläst argt ytbehandla.

Figurera 1. MFPNA-3D - BIO låter samtidiga optiska och AFM-mätningar på en inverterad optisk microsope, ideal för bioscienceapplikationer.

Den ger tredimensionell molekylär upplösning av biologiska molekylar med det inte extra kontrastera medlet (liksom fluorochromen, färger, Etc.) eller kompromissen till ta prov. I tillägg är AFM också en högre upplösningsmätning som är non-flyktig.

Att Använda dessa microscopytekniker ger samtidigt användaren med kickupplösning som avbildar på specifika molekylar och öppnar också, dörren till en bred variation av forskningexperiment. I denna artikel ska vi beskriver instrumentationen och ställer in, tar prov förberedelsen, applikationer och ger experimentella exempel av tekniken.

InstrumentationKrav

Lyckade samtidiga AFM- och FM-mätningar kräver specifika konfigurationer av båda instrumenterar. Först och främst, måste AFMEN inte störa med FM-mätning. Därför Att mest dioder för laser för reklamfilmAFMs bruk röda som exponerar och som avkänner avböjningen av cantileveren, de fluorescerande våglängderna, inte kan observeras. Emellertid använder AsylForskningen MFP-3D en infraröd superluminescent diod med förminskande utsläpp på mest fluorescerande våglängder. Detta låter att beskåda av både fluorescencen, och AFM avbildar (se för att Figurera 2).

Figurera 2. FluorochromeMagnetiseringen (blått) (röd) /Emission och MFP-3D SLD tänder våglängd.

I tillägg har båda mätningar potentiellt motstridiga rumsliga tvång. FM-mikroskopet kräver att ta prov är nästan målen för det inverterade mikroskopet. För AFMEN måste cantileveren också bo nästan ta prov för att avbilda. MFPEN-3D planläggs specifikt, så att ta prov kan tas fram både av det inverterade optiska mikroskopet, och scanningen arrangerar av AFMEN.

MFP--3Dbildläsaren vilar på det bästa av ett inverterat mikroskop och ger nästan obegränsat optiskt tar fram till ta prov underifrån, danande det som är lätt till sammanslutningen med fluorescencemikroskop, den inklusive epifluorescencen, confocal, TIRF och GRINIGHETEN.

Beskrivningen och Ställer In

MFPEN-3D-BIO AFM är ideal instrumenterar för att utföra de samtidiga mätningarna. Detta modellerar har en basera att plätera och en X-Y bildläsare som vilar överst av ett inverterat optiskt mikroskop (som tillverkas av Olympus, Zeiss eller Nikon). Detta arrangerar, och bildläsarordningen låter både den enkla justeringen av AFM-spetsen med den optiska axeln, och submicronpositioneringen av ta prov dimensionerar itu. Den är också kompatibel med någon inverterad numerisk öppning 100X för optisk kick för mål inklusive och TIRF-mål. Figurera shows 1 som en ställa in av MFPEN-3D-BIO monterade på en Nikon TE2000-E utrustade för fluorescence.

Under funktion sänder ut MFPEN-3D AFM infraröd SLD mellan 840 och 880nm. (Se för att Figurera 2), Därför Att mest fluorophores har magnetisering, och nedanföra utsläppvåglängder dessa värderar, finns det någon störning.

Ta Prov Förberedelsen

Ta provförberedelsen för samtidiga mätningar är liknande till det som används för att avbilda för AFM. Emellertid i fluorescencemicroscopy som är ljus signalerar kan vara svimmar. Några allmänningmetoder av ökande effektiviteten av fluorescerande utsläpp kan inte användas i MFPEN-3D, därför att den skulle förhindrar AFM-sonden från kommande in i kontakt med ta prov¨Cen for example och genom att använda ett hydrophobic medel och byta ut bevattna med glycerol eller att tillfoga antioxidants, till förhöjning effektiviteten av fluorescencen.

Dessa metoder kräver typisk att en coverslip förläggas överst av ta prov för att skydda och sylten det. Sedan en sådan coverslip förhindrar AFM-sonden från att påverka varandra med ta prov, kliver denna tar prov in förberedelsen måste utelämnas. I stället måste förberedelsen anpassas till varje tar prov, och beloppet av fluorescerande färg måste att anpassas till nytt avbilda villkorar. Till exempel kan det är nödvändigt till förhöjning beloppet av fluorochromen som går till röran till prov att erhålla ett större signalerar för FM-mätningen. Notera emellertid, att, sedan detta kan resultera i en förlust av den bindande noggrannheten av färgen, och en kompromiss kan behöva att finnas.

Avbilda Exempel

Figurera localizationen för 3 shows av actinglödtrådsläktingen till ytbehandlatopografin av singelceller genom att använda en kombinerad TIRFM/AFM. HeLa celler var fullvuxna på glass mikroskopcoverslips, formaline-fixade, permeabilized med Triton X-100, märkt med TRITC-phalloidin som tvättades med acetonen och torkades. att Avbilda bars ut genom att använda en specialbyggd kombination av MFPEN-3D AFM och ett TIRF-mikroskop som konstruerades på ett Olympus IX81 mikroskop. Topographic och fluorescencedata samlades samtidigt. Topographic data ficks i non-kontakt funktionsläge genom att använda en Syndacantilever (Olympus AC160). Avbilda visar att TIRF-datan kanaliserar överdrat på den framförda AFM-topografin.

Figurera 3. TIRF-data som överdras på framförd AFM-topografi av HeLa Celler. Avbilda Gruppen för artighet Miklós S.Z. Kellermayer, Nanobiotechnology- och Singel-Molekyl Biophysics, Universitetar av Pécs, Ungern.

Figurera 4 shows ett exempel av en epithelial cell. Dessa avbildar togs med ett olje- fluormål för immersion 100X Nikon S. Grå färg avbildar är en brightfield avbildar med något ljust upplysande för extra vit ta provregionen. Detta låter cantileveren (Olympus AC 240) visualiseras som väl. Understödja avbildar i ordna är fluorescencen avbildar. Thirden avbildar är AFMEN avbildar av den samma cellen som tas i AC-funktionsläge. Du kan också se zoomen av det specifika området inom cellregionen.

Figurera 4. Optiskt arrangera gradvis kontrast, fluorescence (B) (A), (C) AFM, och (D) kombinerad AFM/fluorescence av fixade människalungfibroblasts, den 60µm bildläsningen.

Figurera 5 är ett optiskt avbildar av visning för bakterier (Pseudomonas - aeruginosa) ett Grönt Fluorescerande Protein, (GFP) och motsvarande styrka buktar. Avbilda togs med ett mål 10X och använde en fluorescerande Nikon FITCHYQ kub filtrerar. Vit tänder från en fiberkälla var van vid exponerar också cantileveren (som är synlig på vänster sida av avbilda). Bakterierna var först fullvuxna i en medelupphängning. Upphängningen spolades därefter över en glass glidbana för några timmar för att bakterierna för att växa en biofilmanhängare till exponeringsglas. Den glass glidbanan därefter sköljdes med cellkulturmedlet och avbildades i det samma medlet. Cantileveren som används i denna mätning, är 60¦Ìm som långa Olympus Bio-Använder påtryckning (synligt, som ett mörker skuggar i brightfielden, avbilda).

Applikationer

Det finns många applikationexempel av AFM, och epifluorescence¨C Nära Sätter In Avläsande Optiska confocal Sammanlagda Inre för ReflexionsFluorescence- och FluorescenceResonansEnergi (TIRF) för Överföring metoder för Mikroskop (NSOM) (FRET). Forskare kan angå med riskera av att ändra gestaltningen av prov med fluorochromen, således kompromissa litet AFMEN som väl. Emellertid märker det tekniker som minimerar detta problem. En teknik är att sätta in en ändrad och fluorescerande amino syra i ett protein (liksom att sätta in som är methylglyoxal i collagen). Många experiment framlägger inte detta utfärdar alls, när bestämt AFMEN är van vid startar mekaniskt ett prov och att inte avbilda det.

Epifluorescence och AFM

  • Märkande proteiner eller andra delar på ett cellmembran. Epifluorescence är van vid lokaliserar membranet optiskt, och AFM är van vid erhåller en kick - molekylär upplösning avbildar (som visat in Figurera 4) eller mäter mekanisk rekvisita av tar prov (se för att Figurera 5).
  • Att Märka bestämda lipids (lik DPPC) till studien fluiditeten av cellmembranet, genom att korrelera FM och AFM, avbildar.
  • Studera sammansättningen och fördelningen av lipids i vesicles till och med epifluorescence och att använda samtidig AFM för att erhålla data om den mekaniska och viscoelastic rekvisitan av de samma vesiclesna.
  • Gilla carotenoids och klorofyllet, i förhållande till deras optiska uppförande, Studera strukturera av chromophores.
  • Upphetsa Mekaniskt en cell, eller även flödar några receptors på ytbehandla av ett cellmembran med AFMEN och att använda FMEN optiskt för att följa en startad kaskad av biochemical reaktioner, lik Ca2+ insida cellen.

Figurera 5. (Överträffa), Avbildar de optiska var van vid lokaliserar bakterierna och placerar cantileveren. Styrkamätningar gjordes därefter på bakterierna för att bedöma hårdheten av cellen (botten avbildar). Ta prov är Pseudomonas - aeruginosavisningen GFP. I styrkan buktar, buktar blåtten motsvarar till avböjningen av cantileveren, när den återtas från ytbehandla, och det rött buktar motsvarar till avböjningen, som den att närma sig ytbehandla. Jämför styrkan buktar taget på bakterierna till det på en glass substrate. Det mest slå särdrag är den synliga, stora adhesionen (som en negationavböjning på blåtttillbakadragningen buktar). Ta Prov artighet av Frottén Beveridge, Universitetar av Guelph, Kanada.

GRINIGHET och AFM

GRINIGHETEN används för att mäta närhetförbindelse i proteiner, nucleic syror och membran. Genom Att Använda en GRINIGHETmetod, är det möjligheten till studien det dynamiskt av ändringar i gestaltningnågot liknandeDNA eller molekylär växelverkan mellan två enheter. AFM kan användas samtidigt för att visualisera dessa händelser.

NSOM och AFM

Samtidigt avbilda för AFM och för NSOM av topographic avbilda för celltillstånd och beslutsamheten av resårrekvisitan av membranet.

TIRF och AFM

Denna teknik kan vara den van vid studien som svaret av celler till lokaliserade styrkor applicerade via cantileveren på det bästa av cellerna. Allmänare, är den van vid behandlar celler på den jämna nanometeren med den van vid AFM-sonden följer cellreaktionen med fluorescence.

Avslutning

MFPEN-3D-BIO från AsylForskning är instrumentera av primat för samtidiga AFM- och fluorescencemätningar. Dess unika design låter dessa mätningar göras lätt och exakt. Genom enkelt att förändra det normala, tar prov AFM förberedelsen, kan forskare utföra dessa mätningar, och att bredda deras experiment till ett obegränsat numrera av bioscienceapplikationer.

Källa: AsylForskning

För mer information på denna källa behaga besökAsylForskning

Date Added: Jul 26, 2006 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 09:57

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit