同时基本强制和荧光显微法使用 MFP-3D AFM 从收容所研究

包括的事宜

背景
结合基本强制显微学和荧光显微法
手段需求
说明和设置
范例准备
图象示例
应用
Epifluorescence 和 AFM
苦恼和 AFM
NSOM 和 AFM
TIRF 和 AFM
结论

背景

结合基本强制显微学 (AFM)和荧光显微法 (FM)长期是生物学家的利益。 显微镜的这两种类型单个关于范例的唯一情报。

结合基本强制显微学和荧光显微法

荧光显微法典型地用于检测特定分子。 然而,此显微学技术频繁地有一定数量的缺点包括有限空间分辨率和复杂范例准备。 此显微学的另一个限制是这个分子必须一定到荧光染料,反过来,可能修改这个分子的状态。

另一方面, AFM 是用是浏览的交叉表面的悬臂做的评定。

图 1。 MFP-3D - 生物允许在一被倒置的光学 microsope 的同时光学和 AFM 评定,理想对生物科学应用。

它提供生物分子没有另外的不同的作用者 (例如荧光染料、染料等等) 或妥协的三维分子解决方法给这个范例。 另外, AFM 也 是非暂短的更加高分辨率的评定。

使用这些显微学技术同时提供这个用户以高分辨率想象在特定分子并且对各种各样的研究实验打开这个门。 在此条款上,我们将描述手段和设置,范例准备,应用,并且举技术的实验例子。

手段需求

成功的同时 AFM 和 FM 评定要求两台仪器的特定配置。 首要, AFM 不能干涉 FM 评定。 由于阐明和检测悬臂的偏折的多数商业 AFMs 使用红色激光二极管,萤光波长不可能被观察。 然而,收容所研究 MFP-3D 使用有减少的放射至多萤光波长的一个红外 superluminescent 二极管。 这允许查看荧光和 AFM 图象 (参见图 2)。

图 2. 荧光染料励磁 (蓝色) /Emission (红色) 和 MFP-3D SLD 光波长。

另外,两个评定有可能地矛盾的空间的约束。 FM 显微镜要求这个范例是接近倒置显微镜目的。 对 AFM,悬臂必须也位于接近想象的范例。 MFP-3D 特别地被设计,以便这个范例可以由被倒置的光学显微镜和 AFM 的扫描阶段获取。

MFP-3D 扫描程序基于一个倒置显微镜的顶层并且从下面提供几乎对这个范例的无限的光学存取,使它容易与荧光显微镜结合,包括 epifluorescence,共焦, TIRF 和苦恼。

说明和设置

MFP-3D-BIO AFM 是进行同时评定的理想的仪器。 此设计有休息在一个被倒置的光学显微镜顶部的一块基座平板和一个 X - Y 的扫描程序 (制造奥林匹斯山、蔡司或者 Nikon)。 此阶段和扫描程序排列允许 AFM 技巧的简单的对准线与光纤轴的和亚显微确定在二维数的范例。 它也是与所有被倒置的光学目的兼容包括高数值口径 100X 和 TIRF 目的。 图 1 显示为荧光挂接在 Nikon TE2000-E 装备的 MFP-3D-BIO 的设置。

在运算时, MFP-3D AFM 红外 SLD 散发在 840 和 880nm 之间。 由于多数 fluorophores 有励磁和放射波长在这些值下,没有干涉 (参见图 2)。

抽样准备

同时评定的范例准备类似于用于 AFM 想象的那。 然而,在荧光显微法,光信号可以是微弱的。 增加萤光放射效率一些公用方法不可能用于 MFP-3D,因为它将防止 AFM 探测进入与例如范例 ¨C 的联络,使用一个疏水媒体和替换水用丙三醇或者添加抗氧剂,增加荧光的效率。

这些方法典型地要求盖玻片被安置在这个范例顶部保护和保留它。 因为这样盖玻片防止 AFM 探测配合与这个范例,必须省略在范例准备的此步骤。 反而,准备必须为专门制作每个范例,并且相当数量荧光染料必须适应新的想象条件。 例如,增加束缚到这个标本得到 FM 评定的一个更大的信号的数量荧光染料也许是必要的。 附注,然而,因为这可能导致这种染料的约束特异性损失和妥协可能需要被找到。

图象示例

使用联合的 TIRFM/AFM,图 3 显示肌动蛋白细丝的本地化相对单细胞表面地势。 海拉细胞在玻璃显微镜盖玻片增长,甲醛水固定, permeabilized 与氚核 X-100,标记了与 TRITC-phalloidin,洗涤了与丙酮并且被烘干了。 想象被执行了使用 MFP-3D AFM 和在奥林匹斯山 IX81 显微镜修建的 TIRF 显微镜的一个定制的组合。 地形学和荧光数据同时收集了。 使用罪孽悬臂 (奥林匹斯山 AC160),地形学数据在没有接触的模式下获取了。 这个图象显示在被回报的 AFM 地势覆盖的 TIRF 数据通道。

在海拉细胞被回报的 AFM 地势的图 3. 被覆盖的 TIRF 数据。 镜象 Miklós S.Z. Kellermayer, Nanobiotechnology 和单一分子生物物理学组, Pécs,匈牙利大学。

图 4 显示一个上皮细胞的示例。 这些图象采取了与一个油浸 100X Nikon S 流体目的。 灰色图象是与阐明范例区域的若干另外的白光的一个 brightfield 图象。 这允许悬臂 (奥林匹斯山 AC 240) 形象化。 在这个顺序的第二个图象是荧光图象。 第三个图象是在 AC 模式下采取的同一个细胞的 AFM 图象。 您能也看到特定区域的缩放在细胞区域内的。

图 4. (a) 光学阶段对比, (b) 荧光、 (c) AFM 和 (d) 固定的人力肺成纤维细胞联合的 AFM/fluorescence, 60µm 扫描。

图 5 是显示绿色萤光蛋白质和对应的强制曲线的细菌 (绿浓杆菌) 的 (GFP)一个光学图象。 这个图象采取了与目的 10X 并且使用了 Nikon FITCHYQ 多维数据集萤光补白。 从纤维来源的白光也用于照亮悬臂 (可视在图象的左边)。 在媒体暂挂是第一增长的细菌。 暂挂然后被冲洗在一个载玻片一些时数为了细菌能增长到生物薄膜追随者到玻璃。 这个载玻片用细胞培养媒体然后漂洗了和印象在同一个媒体。 用于此评定的悬臂是 60¦Ìm 长的奥林匹斯山生物杠杆 (可视作为在 brightfield 图象的一个暗影)。

应用

有 AFM 和 epifluorescence ¨C 的许多应用程序实例在浏览光学显微镜 (NSOM),共焦,总内部反射率荧光 (TIRF)和荧光共振能调用方法的 (FRET)域附近。 研究员可能牵涉冒着修改这个标本的相应一致的危险到这种荧光染料,因而轻微影响 AFM。 然而,那里标记使此问题减到最小的技术。 一个技术是插入被修改的和萤光氨基酸在蛋白质 (例如插入 methylglyoxal 在胶原)。 特别地当 AFM 用于机械上触发标本和不到图象它时,许多实验根本不存在此问题。

Epifluorescence 和 AFM

  • 标记的蛋白质或其他要素在细胞膜。 Epifluorescence 用于光学上设置膜,并且 AFM 用于得到一个高分子解决方法图象 (如图 4) 或范例的评定机械性能所显示 (参见图 5)。
  • (象 DPPC) 学习细胞膜流动性的标记的某些油脂由关联的 FM 和 AFM 图象。
  • 学习油脂的构成和配电器在泡的通过 epifluorescence 和使用同时 AFM 得到关于同样泡的机械和黏弹性属性的数据。
  • 学习发色团结构,象类胡萝卜素和绿叶素,关于他们的光学工作情况。
  • 请机械上激发细胞甚至有些感受器官在细胞膜的表面有 AFM 和使用的 FM 光学上按照生物化学的回应被触发的级联,象 Ca2+ 流在这个细胞里面。

图 5. (顶层) 光学图象用于设置细菌和确定悬臂。 强制评定在细菌然后做估计这个细胞 (底部图象) 的坚硬。 这个范例是显示 GFP 的绿浓杆菌。 在强制曲线,蓝色曲线对应于悬臂的偏折,当它从表面时被提取,并且红色曲线对应于偏折,当它处理表面。 与那比较在细菌采取的强制曲线在玻璃基体。 这个最醒目的功能是大黏附力 (可视作为在蓝色收缩曲线的负偏折)。 抽样特里 Beveridge,礼貌圭尔夫大学,加拿大。

苦恼和 AFM

苦恼为评定接近度关系使用在蛋白质、核酸和膜。 使用苦恼方法,学习二个实体之间的动态在相应一致上的变化象脱氧核糖核酸或者分子交往是可能的。 AFM 可以同时用于形象化这些活动。

NSOM 和 AFM

细胞同时 AFM 和 NSOM 想象允许地形学想象和膜的有弹性属性的确定。

TIRF 和 AFM

此技术可以用于学习细胞回应对通过在细胞的上面的悬臂被应用的局限化的强制。 一般,它用于操作在毫微米级别上的细胞与用于的 AFM 探测按照细胞回应与荧光。

结论

收容所研究的 MFP-3D-BIO 是选择的仪器同时 AFM 和荧光评定的。 其唯一设计允许这些评定容易地和精密地做。 通过修改正常 AFM 范例准备,研究员能进行这些评定和扩展他们的实验到生物科学应用的一个不可限量的编号。

来源: 收容所研究

关于此来源的更多信息请参观收容所研究

Date Added: Jul 26, 2006 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 09:12

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