同時基本強制和熒光顯微法使用 MFP-3D AFM 從收容所研究

包括的事宜

背景
結合基本強制顯微學和熒光顯微法
手段需求
說明和設置
範例準備
圖像示例
應用
Epifluorescence 和 AFM
苦惱和 AFM
NSOM 和 AFM
TIRF 和 AFM
結論

背景

結合基本強制顯微學 (AFM)和熒光顯微法 (FM)長期是生物學家的利益。 顯微鏡的這兩種類型單個關於範例的唯一情報。

結合基本強制顯微學和熒光顯微法

熒光顯微法典型地用於檢測特定分子。 然而,此顯微學技術頻繁地有一定數量的缺點包括有限空間分辨率和複雜範例準備。 此顯微學的另一個限制是這個分子必須一定到熒光染料,反過來,可能修改這個分子的狀態。

另一方面, AFM 是用是瀏覽的交叉表面的懸臂做的評定。

圖 1。 MFP-3D - 生物允許在一被倒置的光學 microsope 的同時光學和 AFM 評定,理想對生物科學應用。

它提供生物分子沒有另外的不同的作用者 (例如熒光染料、染料等等) 或妥協的三維分子解決方法給這個範例。 另外, AFM 也 是非暫短的更加高分辨率的評定。

使用這些顯微學技術同時提供這個用戶以高分辨率想像在特定分子並且對各種各樣的研究實驗打開這個門。 在此條款上,我們將描述手段和設置,範例準備,應用,并且舉技術的實驗例子。

手段需求

成功的同時 AFM 和 FM 評定要求兩臺儀器的特定配置。 首要, AFM 不能干涉 FM 評定。 由於闡明和檢測懸臂的偏折的多數商業 AFMs 使用紅色激光二極管,螢光波長不可能被觀察。 然而,收容所研究 MFP-3D 使用有減少的放射至多螢光波長的一個紅外 superluminescent 二極管。 這允許查看熒光和 AFM 圖像 (參見圖 2)。

圖 2. 熒光染料勵磁 (藍色) /Emission (紅色) 和 MFP-3D SLD 光波長。

另外,兩個評定有可能地矛盾的空間的約束。 FM 顯微鏡要求這個範例是接近倒置顯微鏡目的。 对 AFM,懸臂必須也位於接近想像的範例。 MFP-3D 特別地被設計,以便這個範例可以由被倒置的光學顯微鏡和 AFM 的掃描階段獲取。

MFP-3D 掃描程序基於一個倒置顯微鏡的頂層并且從下面提供幾乎對這個範例的無限的光學存取,使它容易與熒光顯微鏡結合,包括 epifluorescence,共焦, TIRF 和苦惱。

說明和設置

MFP-3D-BIO AFM 是進行同時評定的理想的儀器。 此設計有休息在一個被倒置的光學顯微鏡頂部的一塊基座平板和一個 X - Y 的掃描程序 (製造奧林匹斯山、蔡司或者 Nikon)。 此階段和掃描程序排列允許 AFM 技巧的簡單的對準線與光纖軸的和亞顯微確定在二維數的範例。 它也是與所有被倒置的光學目的兼容包括高數值口徑 100X 和 TIRF 目的。 圖 1 顯示為熒光掛接在 Nikon TE2000-E 裝備的 MFP-3D-BIO 的設置。

在運算時, MFP-3D AFM 紅外 SLD 散發在 840 和 880nm 之間。 由於多數 fluorophores 有勵磁和放射波長在這些值下,沒有干涉 (參見圖 2)。

抽樣準備

同時評定的範例準備類似於用於 AFM 想像的那。 然而,在熒光顯微法,光信號可以是微弱的。 增加螢光放射效率一些公用方法不可能用於 MFP-3D,因為它將防止 AFM 探測進入與例如範例 ¨C 的聯絡,使用一個疏水媒體和替換水用丙三醇或者添加抗氧劑,增加熒光的效率。

這些方法典型地要求蓋玻片被安置在這個範例頂部保護和保留它。 因為這樣蓋玻片防止 AFM 探測配合與這個範例,必須省略在範例準備的此步驟。 反而,準備必須為專門製作每個範例,并且相當數量熒光染料必須適應新的想像條件。 例如,增加束縛到這個標本得到 FM 評定的一個更大的信號的數量熒光染料也許是必要的。 附註,然而,因為這可能導致這種染料的約束特異性損失和妥協可能需要被找到。

圖像示例

使用聯合的 TIRFM/AFM,圖 3 顯示肌動蛋白細絲的本地化相對單細胞表面地勢。 海拉細胞在玻璃顯微鏡蓋玻片增長,甲醛水固定, permeabilized 與氚核 X-100,標記了與 TRITC-phalloidin,洗滌了與丙酮并且被烘乾了。 想像被執行了使用 MFP-3D AFM 和在奧林匹斯山 IX81 顯微鏡修建的 TIRF 顯微鏡的一個定製的組合。 地形學和熒光數據同時收集了。 使用罪孽懸臂 (奧林匹斯山 AC160),地形學數據在沒有接觸的模式下獲取了。 這個圖像顯示在被回報的 AFM 地勢覆蓋的 TIRF 數據通道。

在海拉細胞被回報的 AFM 地勢的圖 3. 被覆蓋的 TIRF 數據。 鏡像 Miklós S.Z. Kellermayer, Nanobiotechnology 和單一分子生物物理學組, Pécs,匈牙利大學。

圖 4 顯示一個上皮細胞的示例。 這些圖像採取了與一個油浸 100X Nikon S 流體目的。 灰色圖像是與闡明範例區域的若乾另外的白光的一個 brightfield 圖像。 這允許懸臂 (奧林匹斯山 AC 240) 形象化。 在這個順序的第二個圖像是熒光圖像。 第三個圖像是在 AC 模式下採取的同一個細胞的 AFM 圖像。 您能也看到特定區域的縮放在細胞區域內的。

圖 4. (a) 光學階段對比, (b) 熒光、 (c) AFM 和 (d) 固定的人力肺成纖維細胞聯合的 AFM/fluorescence, 60µm 掃描。

圖 5 是顯示綠色螢光蛋白質和對應的強制曲線的細菌 (綠濃桿菌) 的 (GFP)一個光學圖像。 這個圖像採取了與目的 10X 并且使用了 Nikon FITCHYQ 多維數據集螢光補白。 從纖維來源的白光也用於照亮懸臂 (可視在圖像的左邊)。 在媒體暫掛是第一增長的細菌。 暫掛然後被沖洗在一個載玻片一些時數為了細菌能增長到生物薄膜追隨者到玻璃。 這個載玻片用細胞培養媒體然後漂洗了和印象在同一個媒體。 用於此評定的懸臂是 60¦Ìm 長的奧林匹斯山生物槓桿 (可視作為在 brightfield 圖像的一個暗影)。

應用

有 AFM 和 epifluorescence ¨C 的許多應用程序實例在瀏覽光學顯微鏡 (NSOM),共焦,總內部反射率熒光 (TIRF)和熒光共振能調用方法的 (FRET)域附近。 研究員可能牽涉冒著修改這個標本的相應一致的危險到這種熒光染料,因而輕微影響 AFM。 然而,那裡標記使此問題減到最小的技術。 一個技術是插入被修改的和螢光氨基酸在蛋白質 (例如插入 methylglyoxal 在膠原)。 特別地當 AFM 用於機械上觸發標本和不到圖像它時,許多實驗根本不存在此問題。

Epifluorescence 和 AFM

  • 標記的蛋白質或其他要素在細胞膜。 Epifluorescence 用於光學上設置膜,并且 AFM 用於得到一個高分子解決方法圖像 (如圖 4) 或範例的評定機械性能所顯示 (參見圖 5)。
  • (像 DPPC) 學習細胞膜流動性的標記的某些油脂由關聯的 FM 和 AFM 圖像。
  • 學習油脂的構成和配電器在泡的通過 epifluorescence 和使用同時 AFM 得到關於同樣泡的機械和黏彈性屬性的數據。
  • 學習髮色團結構,像類胡蘿卜素和綠葉素,關於他們的光學工作情況。
  • 请機械上激發細胞甚至有些感受器官在細胞膜的表面有 AFM 和使用的 FM 光學上按照生物化學的回應被觸發的級聯,像 Ca2+ 流在這個細胞裡面。

圖 5. (頂層) 光學圖像用於設置細菌和確定懸臂。 強制評定在細菌然後做估計這個細胞 (底部圖像) 的堅硬。 這個範例是顯示 GFP 的綠濃桿菌。 在強制曲線,藍色曲線對應於懸臂的偏折,當它從表面時被提取,并且紅色曲線對應於偏折,當它處理表面。 與那比較在細菌採取的強制曲線在玻璃基體。 這個最醒目的功能是大黏附力 (可視作為在藍色收縮曲線的負偏折)。 抽樣特里 Beveridge,禮貌圭爾夫大學,加拿大。

苦惱和 AFM

苦惱為評定接近度關係使用在蛋白質、核酸和膜。 使用苦惱方法,學習二個實體之間的動態在相應一致上的變化像脫氧核糖核酸或者分子交往是可能的。 AFM 可以同時用於形象化這些活動。

NSOM 和 AFM

細胞同時 AFM 和 NSOM 想像允許地形學想像和膜的有彈性屬性的確定。

TIRF 和 AFM

此技術可以用於學習細胞回應對通過在細胞的上面的懸臂被應用的局限化的強制。 一般,它用於操作在毫微米級別上的細胞與用於的 AFM 探測按照細胞回應與熒光。

結論

收容所研究的 MFP-3D-BIO 是選擇的儀器同時 AFM 和熒光評定的。 其唯一設計允許這些評定容易地和精密地做。 通過修改正常 AFM 範例準備,研究員能進行這些評定和擴展他們的實驗到生物科學應用的一個不可限量的編號。

來源: 收容所研究

關於此來源的更多信息请請參觀收容所研究

Date Added: Jul 26, 2006 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 09:15

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