Siden sin opfindelse, har atomic force mikroskop (AFM) blevet brugt til billede en bred vifte af forskellige prøver. Da AFM er blevet ændret sådan, at det kunne billedet prøver i buffer blev det muligt at løse biologiske spørgsmål under fysiologiske forhold med denne teknik. Den detalje i atomic force billeder er uden sidestykke med andre mikroskopi teknikker, der kan bruges til billede prøver i væske, på grund af signal støjforhold af instrumentet. Hertil kommer, tørrede prøver at bevare strukturen ikke behøver at blive yderligere behandlet for at skabe kontrast. NanoWizard BioAFM Den NanoWizard ® BioAFM fra JPK Instruments har en række funktioner, der forbedrer kapaciteten af denne teknologi til den højeste opløsning billeddannelse af biologiske prøver. Nemlig, at JPK Nanowizard er ® lineariseret i alle tre dimensioner. Det vil sige, at der er et lukket kredsløb feedback, der sikrer præcis positionering i x-og y-akser samt i z-aksen. Derudover Nanowizard ® udvider anvendeligheden af atomic force mikroskopi (AFM) til billeddannelse ved at muliggøre samtidig AFM billeddannelse med ekstra optisk mikroskopiske teknikker. Begge disse funktioner kan spare brugeren tid og ressourcer, når stræben efter det perfekte, høj opløsning billede. Atomic Lattice af glimmer Overlegen teknik og stabilitet er nødvendig for erhvervelse af billeder i høj opløsning. For at demonstrere stabiliteten af JPK Nanowizard ®, selv når det installeres på en omvendt lysmikroskop, var frisk kløvet glimmer filmede i kontakt tilstand i luften. Det atomare gitter af glimmer kan tydeligt ses (figur 1).  Figur 1. Mica filmede i kontakt mode. Scan størrelse, 40 x 60 A Hexagonal Medbragt mellemlag Den Hexagonal pakket mellemliggende (HPI) lag af archaebacteria, Deinococcus radiodurans, er blevet grundigt undersøgt ved hjælp af atomic force mikroskopi.  Figur 2. (A) HPI lag plaster på glimmer, filmede i lukkede kredsløb kontakt-tilstand, i væske. (B) Høj opløsning billede af HPI subunit porer. Rød cirkel - eksempel på en lukket pore, blå cirkel - eksempel på en åben pore. Fejl i gitter er også tydeligt, fx de manglende subunit i pore markeret med en hvid pil. Billede (B) venligst udlånt af Dr. Patrick Frederix, Universitet af Basel . Den HPI lag af D. radiodurans danner en overflade, der formodes at fungere som en slags molekylær si til at regulere transporten af næringsstoffer og metabolitter ind og ud af cellen. Data er genereret på struktur og funktion af HPI lag ved hjælp af en række forskellige teknikker, lige fra biokemi til elektronmikroskopi. Dog kan AFM billeder af denne prøve udføres i væske, i høj opløsning, for at følge dynamiske ændringer i proteiners struktur. Den HPI lag er udvundet af hele celler med opvaskemiddel og derefter adsorberet til en frisk kløvet glimmer overflade. Den stabile pakning af de enkelte protein elementer fremmer tilegnelsen af billeder i høj opløsning. Den HPI lag danner pletter på glimmer overfladen, og overblik billeder af disse patches allerede nu afsløre den regelmæssige gitter-struktur HPI lag (figur 2, A). Efter købet af en oversigt billede af en HPI membran patch, kan en egnet region blive udvalgt til billedbehandling på højere opløsning (figur 2, B). Da XY positionering af JPK Nanowizard ® er kontrolleret af en lukket loop feedback system instrumentet vil "zoome ind" for at det valgte område med høj nøjagtighed. Dette gør brugeren i stand til at tage færre scanninger, hvilket mindsker sandsynligheden for at forurene spidsen eller beskadige membranen patch. Nuclear Pore Complex Den eukaryote celle er organiseret i rum kaldet organeller. Kontrolleret transport på tværs af membraner omgiver hvert organel gør det muligt for cellen at inddeler specifikke molekyler, en proces, der ligger til grund cellulære funktion. I kernemembranen, er den nukleare pore komplekset (NPC) med ansvar for transport af forskellige molekyler ind og ud af kernen.  Figur 3. DIC billede af NPC prøve. Brugen af DIC klart højdepunkter vragrester. I modsætning til HPI lag af D. radiodurans, gøre forberedelser af NPC ikke blot indeholder NPC kondenseret i et gitter. Prøverne er fremstillet af hele kerner, i dette tilfælde fra Xenopus laevis, og kan være ret uensartet. Da life science version af JPK Nanowizard ® er fuldt integreret i en omvendt, lysmikroskop, kan transmission mikroskopi kan bruges til at scanne prøven for en region, som ikke indeholder store mængder af affald, før scanning. På en sådan måde, at brugeren kan igen reducere den tid, der kræves til at finde et egnet område til scanning, og mindske chancen for at forurene spidsen.  Figur 4. Kontakt tilstand billeder af NPC på et dækglas. En oversigt billede viser en blanding af NPC og forurenende materiale. Den JPK Nanowizard ® kan så præcist zoome ind på områder af interesse for højere-detail scanninger. NPC prøver, på et dækglas, filmede var ved hjælp af forskellen interferens kontrast (DIC) mikroskopi, klart highlighting vragrester, der ville være umuligt at visualisere bruge klare felt mikroskopi (figur 3). Spidsen blev derefter placeret over et område med minimal vragrester og overblik scanning erhvervet (Figur 4). Igen capacitively kontrolleret tilbagemeldinger derefter giver præcis markering af et område for en højere opløsning scanning. DNA-Imaging De fleste af de data, der genereres på struktur og funktion af DNA er kommet fra inden for molekylær biologi. Men med det signal støjforhold på AFM denne fundamentalt vigtige biologiske molekyle kan studeres på høj opløsning i flydende og i luften, at belyse fysiske struktur og samspillet mellem DNA med DNA-bindende molekyler. Under de rette betingelser, kan DNA blive adsorberet til frisk kløvet glimmer og afbildet i buffer. Figur 5 viser Lambda fag DNA (AC-tilstand i væske).  Figur 5. Topographs af Lambda fag DNA, filmede i sporadisk kontakt tilstand i væske. Farveskala 0-2 nm for både A og B. Samspillet mellem forskellige proteiner med DNA er af afgørende betydning i de processer af replikation og transskription. Et eksempel er foreningen af DNA med histoner til at danne nucleosomes. Denne kondensering af DNA omkring nucleosome kerne (bestaaende af et histon octamer) spiller en rolle i reguleringen af DNA-replikation og transskription, da kondenseret DNA ikke er tilgængeligt for andre DNA-bindende proteiner.  Figur 6. AC-tilstand topograph af DNA-nucleosome komplekser. Proteinet kan klart adskilles indbindes langs længden af lineariseret pGEM plasmid. Billede venligst udlånt af Dr. Clemens Franz, Technical University of Dresden. I dette tilfælde var det lineariseret, 3 kb plasmid pGEM inkuberes med nucleosomes i et forhold på 1 mol DNA til 20 mol histon octamers. Den pGEM plasmid har 20 formodede nucleosome bindingssteder, dog kan det ses, at under inkubationen betingelser, gjorde nucleosomes ikke binde alle 20 bindingssteder (Fig 6). Konklusioner Det signal støjforhold, manglende krav om farvning eller forbehandling og evne til at fungere i flydende gør AFM billeddannelse en ekstremt kraftfuld metode til at beskrive, i høj opløsning, strukturen af biologiske prøver. Udformningen af JPK Nanowizard ® kan lette en sådan høj opløsning undersøgelser. For eksempel reducerer præcis placering i x og y (på grund af closed loop feedback) antallet af scanninger, der kræves for "fokus" i høj opløsning på en region af interesse. Dette mindsker sandsynligheden for at beskadige sarte prøver og for at forurene spidsen. For prøver fremstillet på glas, som det nukleare pore komplekse beskrevet ovenfor, kan forurene vragrester let undgås ved at søge efter et egnet område ved hjælp af transmission lysmikroskopi, igen sparer brugeren tid. Fordelen ved at bruge AFM til sådanne billeddiagnostiske undersøgelser ligger i evnen til AFM til billede prøver i væske, under fysiologiske betingelser. JPK Instruments fremstiller Biocell ™, der kan gøre det muligt for brugeren at ændre forholdene under scanning (Figur 7), som f.eks kontrolleret temperatur ændringer eller in situ tilsætning af relevante molekyler, som yderligere forbedrer anvendeligheden af JPK Nanowizard ® til den højeste opløsning billeddannelse af biologiske prøver.  Figur 7. Den JPK Biocell ™. Den Biocell ™ er designet til at muliggøre optimal billeddannelse betingelser for både AFM og optiske metoder, samtidig med mulighed for hurtig og præcis temperatur styring fra 20-60 ° C. Den JPK Nanowizard ®, integreret i en omvendt lysmikroskop, er også optimeret til billeddannelse af andre biologiske prøver, fra lipid dobbeltlag og biopolymerer, såsom kollagen til hele celler. AFM billeder af sådanne prøver kan suppleres med yderligere lysmikroskopi teknikker, såsom laser scanning konfokal, epifluorescence TIRF eller FRET. Den JPK Nanowizard ® er også blevet anvendt til at kvantificere uforpligtende kræfter, fra individuelle proteiner til cellcell interaktioner. Som sådan, de JPK Nanowizard ® BioAFM er perfekt til at gennemføre imaging og kraft målinger af biologiske prøver fra individuelle proteiner til hele celler under kontrollerede, fysiologiske forhold. Anerkendelser Mange tak til alle dem, der har bidraget prøver og billeder. Den høje opløsning af HPI blev leveret af Dr. Patrick Frederix fra gruppen af Prof. Engel, Universitet af Basel . Den NPC Prøven var en slags gave fra Barbara Windoffer i gruppen af Prof. Dr. Oberleithner, Universitätsklinikum Münster. DNA-histon prøve blev udarbejdet af Dr. Dennis Merkel (Prof. Schwille gruppe) og filmede af Dr. Clemens Franz (Prof. Müller gruppe) både af Dresden Teknologiske Universitet. |